[发明专利]一种紫杉醇菌株的筛选方法及其半定量分析

摘要

本发明公布了一种紫杉醇菌株的筛选方法及其半定量分析，属于微生物发酵产物的测定与检验方法技术领域，包括紫杉醇标准溶液的配制、真菌发酵与薄层层析、紫杉醇菌株的筛选与半定量分析方法等。称取紫杉醇标准品2mg，溶解于10mL三氯甲烷，配制成0.2mg/mL标准溶液；分离红豆杉内生真菌纯培养物进行液体发酵；对发酵液的滤液萃取后收集有机相，获得内生真菌发酵液的萃取物；将标准紫杉醇溶液或真菌发酵产物的萃取物进行薄层层析与显色反应；根据显色反应结果可以从红豆杉内生真菌中筛选到紫杉醇菌株并对菌株的紫杉醇产量进行半定量分析。本发明重现性较好，灵敏度较高，专一性较强，筛选效率较高，与高效液相色谱等分析方法相比较具有更低的设备和技术要求。

主权项

一种紫杉醇菌株的筛选方法及其半定量分析，包括紫杉醇标准溶液的配制、真菌发酵产物的制备，其特征在于：还包括薄层层析与显色反应、紫杉醇菌株的筛选和菌株紫杉醇产量的半定量分析，（1）真菌发酵产物的制备：选取若干红豆杉植物的组织块进行表面消毒，分离内生真菌纯培养物；将得到的菌株充分活化，转接入50mL种子培养基，22℃、130 rpm/min，恒温振荡培养3天获得发酵种子；以20%（体积比）接种量，转接100mL发酵培养基，22℃，110 rpm/min，恒温振荡培养15天后完成发酵；过滤内生真菌的发酵产物，滤液用等体积的氯仿‑甲醇液(10/1，体积比)萃取2次，收集有机相，即真菌发酵产物的萃取物；（2）紫杉醇标准溶液的配制：称取紫杉醇标准品2mg，溶解于10mL三氯甲烷，配制成0.2 mg/mL标准溶液；（3）薄层层析与显色反应：称取10g硅胶，加入无菌蒸馏水后充分搅匀，湿法铺板，110℃烘干活化0.5 小时，制成硅胶板，置于干燥器内备用；层析时，点样于硅胶板上，使用氯仿‑甲醇液(7/1，体积比)作为展开剂直立上行展开，层析完成后将层析板取出稍微挥干，使用含有1‑3wt%香草醛的浓硫酸液喷雾显色；（4）紫杉醇菌株的筛选：将步骤（1）得到的真菌发酵产物的萃取物和步骤（2）的紫杉醇标准溶液同时点样于硅胶板，在展开缸内进行如步骤（3）中薄层层析和显色反应，萃取物在层析板上如果形成与标准溶液迁移率(Rf)相同的蓝色斑点，即确认为该内生真菌可以产生紫杉醇；（5）真菌菌株紫杉醇产量的半定量分析：将步骤（2）配制好的0.2 mg/mL紫杉醇标准溶液，使用微量进样器分别吸取5、25、45、65、85 µL，点样于硅胶板上，在展开缸内进行如步骤（3）中薄层层析和显色反应，形成深浅不同的蓝色斑点。