[发明专利]双酶法制备分子量可控的药用右旋糖酐

摘要

本发明涉及一种双酶法制备分子量可控的药用右旋糖酐，其产品种类包括右旋糖酐70，右旋糖酐40以及右旋糖酐20；其制备步骤分为两大步，第一大步为高分子右旋糖酐的合成，首先是采用右旋糖酐蔗糖酶催化蔗糖制备高分子右旋糖酐，该新方法使蔗糖转化为右旋糖酐的转化率达到95%以上；第二大步为高分子右旋糖的可控性降解，采用高酶活性的右旋糖酐酶催化降解高分子右旋糖酐为药用右旋糖酐，实现右旋糖酐的分子量可控降解；反应结束后采用简单的过滤方法去除产品中的杂蛋白，采用乙醇分级醇沉获得不同分子量右旋糖酐。该方法不仅绿色、环保、低成本、简便；而且能够大幅度提高产品收率，获得高品质药用右旋糖酐。

主权项

双酶法制备分子量可控的药用右旋糖酐，其特征在于，该方法按如下步骤进行：（1）右旋糖酐蔗糖酶合成高分子右旋糖酐，采用pH 5.4 0.02 mol/L醋酸‑醋酸钠缓冲液配制终体积浓度12%的蔗糖溶液1000 mL，所述缓冲液中添加0.05g/L CaCl2；将配置好的蔗糖溶液置于25℃保温10 min后，加入右旋糖酐蔗糖酶使其终浓度为2 IU/mL，置于25℃恒温、120r/min反应4小时，再置于25℃条件下保温20小时；然后终止右旋糖酐蔗糖酶的催化反应，将反应液用于下一步右旋糖酐酶的催化水解；所述右旋糖酐蔗糖酶的一个酶活IU是指，以pH5.4的醋酸‑醋酸钙缓冲液配制终体积浓度为10%的蔗糖溶液为底物；所述缓冲液中含醋酸钙 0.05 g/L、冰醋酸0.02 mol/L；25℃条件下，每毫升底物反应液中每小时催化蔗糖产生0.1 mg果糖所需要的酶量；（2）右旋糖酐酶催化水解高分子右旋糖酐向步骤1）经右旋糖酐蔗糖酶催化合成的反应液中加入右旋糖酐酶使其终浓度为0.23 U/mL，置于35℃条件下搅拌反应160min‑180 min，然后终止酶促反应；所述右旋糖酐酶的一个酶活U是指，以pH 5.0的醋酸盐缓冲液配制的终体积浓度为3%的重均分子量为70 kDa的右旋糖酐溶液为底物，在35℃条件下，每分钟产生1μmol还原糖所需要的右旋糖酐酶量；（3）去除杂质将上述步骤2）经右旋糖酐酶催化水解的反应液置于80℃保温3小时，随后采用多层纱布过滤杂质，重复过滤两次，随后采用中速定性滤纸过滤上清液；然后再将上述过滤后的上清液加热煮沸15 min，待上清液冷却后，再利用中速定性滤纸过滤去除杂质，清澈无色的滤液用于下一步乙醇分级醇沉；（4）乙醇分级醇沉及真空干燥采用4级划分，一级划分乙醇体积浓度为39%，在搅拌装置下，向步骤（3）所得滤液中缓慢加入体积浓度95%乙醇，定时测定滤液中乙醇体积浓度，当乙醇体积浓度达到39%时停止醇沉，将滤液置于40度保温22小时，然后倒出上清液，再向沉淀中加入适量乙醇取出大分子杂质；二级划分乙醇体积浓度为43%，向一级划分后的上清液中缓慢加入体积浓度95%的乙醇，具体操作同上，待滤液乙醇体积浓度达43%时，停止醇沉，将醇沉好的滤液置于34度保温22小时，然后倒出上清液，再向沉淀中加入乙醇获得右旋糖酐70产品；三级划分乙醇浓度为47%，向二级划分后的上清液中缓慢加入体积浓度95%的乙醇，具体操作同 上，待滤液乙醇体积浓度达47%时，停止醇沉，将醇沉好的虑液置于40度保温12小时，倒出上清液，再向沉淀中加入乙醇获得右旋糖酐40产品；四级划分乙醇浓度为57%，向三级划分后的上清液中缓慢加入体积浓度95%的乙醇，具体操作同上，待滤液乙醇体积浓度达57%时，停止醇沉，将醇沉好的虑液置于常温，2小时后，再加入乙醇获得右旋糖酐20产品；将上述乙醇划分所得到的产品分别置于80℃真空干燥箱中干燥4小时，去除产品中残留的乙醇及水分，即得到相应的右旋糖酐产品。