[发明专利]基因重组人生长激素的制备方法

摘要

一种基因重组人生长激素的制备方法，包括步骤：基因的获得、载体pPIC9K与Ⅰ型人胶原蛋白以及人生长激素的连接、毕赤酵母电转化、多拷贝插入重组子的筛选、前导肽-人生长激素融合蛋白毕赤酵母发酵、基因重组人生长激素的纯化步骤。本发明以Ⅰ型胶原蛋白302～346基序作为前导肽引导人生长激素高表达，通过毕赤酵母高密度发酵及一系列纯化方法获得高纯度的人生长激素，为重组人生长激素临床应用的进一步扩展奠定了基础。本发明具有生产工艺简单、蛋白表达量高、纯度高的特点，可用于制备基因重组人生长激素。

主权项

一种基因重组人生长激素的制备方法，其特征在于它包括下述步骤：（1）基因的获得从离体新生儿胎盘组织中提取总RNA，反转录获得cDNA，设计Ⅰ型人胶原蛋白302～346基序前导肽和人生长激素 PCR扩增引物，引入限制性酶切位点XhoⅠ、EcoRⅠ、NotⅠ、α信号肽切割位点AAACGAGAAGCT，Ⅰ型人胶原蛋白302～346基序前导肽和人生长激素的引物序列如下；Ⅰ型人胶原蛋白302～346基序前导肽引物序列：F: CGCTCGAGGGCCCCCGTGGCCTGCR: CGGAATTCAGGGAAGCCAGGAGGACCAG人生长激素引物序列：F: GCGAATTCAAACGAGAAGCTTTCCCAACCATTCCCTTATCR: TAGCGGCCGCCTAGAAGCCACAGCTGC采用PCR方法扩增获得Ⅰ型人胶原蛋白302～346基序前导肽和人生长激素基因；Ⅰ型人胶原蛋白302～346基序前导肽的基因序列如下：1        GGCCCCCGTG GCCTGCCTGG TGAGAGAGGT CGCCCTGGAG CCCCTGGCCC TGCTGGTGCT61       CGTGGAAATG ATGGTGCTAC TGGTGCTGCC GGGCCCCCTG GTCCCACCGG CCCCGCTGGT121      CCTCCTGGCT TCCCT人生长激素基因序列如下：1        TTCCCAACCA TTCCCTTATC CAGGCTTTTT GACAACGCTA TGCTCCGCGC CCGTCGCCTG61       TACCAGCTGG CATATGACAC CTATCAGGAG TTTGAAGAAG CCTATATCCT GAAGGAGCAG121      AAGTATTCAT TCCTGCAGAA CCCCCAGACC TCCCTCTGCT TCTCAGAGTC TATTCCAACA181      CCTTCCAACA GGGTGAAAAC GCAGCAGAAA TCTAACCTAG AGCTGCTCCG CATCTCCCTG241      CTGCTCATCC AGTCATGGCT GGAGCCCGTG CAGCTCCTCA GGAGCGTCTT CGCCAACAGC301      CTGGTGTATG GCGCCTCGGA CAGCAACGTC TATCGCCACC TGAAGGACCT AGAGGAAGGC361      ATCCAAACGC TGATGTGGAG GCTGGAAGAT GGCAGCCCCC GGACTGGGCA GATCTTCAAT421      CAGTCCTACA GCAAGTTTGA CACAAAATCG CACAACGATG ACGCACTGCT CAAGAACTAC481      GGGCTGCTCT ACTGCTTCAG GAAGGACATG GACAAGGTCG AGACATTCCT GCGCATCGTG541      CAGTGCCGCT CTGTGGAGGG CAGCTGTGGC TTCTAG（2）载体pPIC9K与Ⅰ型人胶原蛋白以及人生长激素的连接    对载体pPIC9K、Ⅰ型人胶原蛋白进行XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K‑Leader；对pPIC9K‑Leader质粒与人生长激素分别进行EcoRⅠ及NotⅠ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K‑Leader‑GH；该重组DNA序列如下：1        CTCGAGGGCC CCCGTGGCCT GCCTGGTGAG AGAGGTCGCC CTGGAGCCCC TGGCCCTGCT61       GGTGCTCGTG GAAATGATGG TGCTACTGGT GCTGCCGGGC CCCCTGGTCC CACCGGCCCC 121      GCTGGTCCTC CTGGCTTCCC TGAATTCAAA CGAGAAGCTT TCCCAACCAT TCCCTTATCC181      AGGCTTTTTG ACAACGCTAT GCTCCGCGCC CGTCGCCTGT ACCAGCTGGC ATATGACACC241      TATCAGGAGT TTGAAGAAGC CTATATCCTG AAGGAGCAGA AGTATTCATT CCTGCAGAAC301      CCCCAGACCT CCCTCTGCTT CTCAGAGTCT ATTCCAACAC CTTCCAACAG GGTGAAAACG361      CAGCAGAAAT CTAACCTAGA GCTGCTCCGC ATCTCCCTGC TGCTCATCCA GTCATGGCTG421      GAGCCCGTGC AGCTCCTCAG GAGCGTCTTC GCCAACAGCC TGGTGTATGG CGCCTCGGAC481      AGCAACGTCT ATCGCCACCT GAAGGACCTA GAGGAAGGCA TCCAAACGCT GATGTGGAGG541      CTGGAAGATG GCAGCCCCCG GACTGGGCAG ATCTTCAATC AGTCCTACAG CAAGTTTGAC601      ACAAAATCGC ACAACGATGA CGCACTGCTC AAGAACTACG GGCTGCTCTA CTGCTTCAGG661      AAGGACATGG ACAAGGTCGA GACATTCCTG CGCATCGTGC AGTGCCGCTC TGTGGAGGGC721      AGCTGTGGCT TCTAGGCGGC CGC（3）毕赤酵母电转化将10μg经SalⅠ内切酶线性化的pPIC9K‑Leader‑GH质粒，与80μL毕赤酵母GS115感受态细胞混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，电击4～10毫秒，加入1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，30 ℃倒置培养2～3天，在MD培养基平板上长出菌落；（4）多拷贝插入重组子的筛选将MD培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到G418浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，30℃培养，筛选获得转化子；（5）前导肽‑人生长激素融合蛋白毕赤酵母发酵将筛选到的基因工程菌接种于400ml BMGY培养基中，30 ℃振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4L FBS培养基的5L发酵罐中，温度设定为30 ℃，pH 值为5.0，培养16～20小时，作为二级种子转接入装有FBS培养基的150L大罐发酵，生长温度30℃，诱导温度29℃，pH 值为4.5，溶氧控制在20%～30%，流加入质量浓度为75%的含12 mL/L PTM1 微量元素的甲醇水溶液，FBS培养基与质量浓度为75%的含12 mL/L PTM1 微量元素的甲醇水溶液的体积比为1:0.25，诱导发酵36～42小时。在蛋白发酵分泌表达出胞外的过程中，细胞壁中所含有的蛋白酶切割α信号肽切割位点，切割出人生长激素；（6）基因重组人生长激素的纯化发酵结束后，发酵液离心分离，取上清液，用分子截留量为60000D或80000D或100000D的中空纤维超滤系统进行超滤，收集滤过液，用分子量为6000D或10000D的卷式超滤膜超滤，收集浓缩液，得人生长激素粗蛋白浓缩液；用Sephacryl S100分子筛层析分离人生长激素粗蛋白浓缩液，然后用DEAE Sepharose FF阴离子交换层析，收集洗脱液，超滤脱盐浓缩，冷冻干燥，获得基因重组人生长激素, 基因重组人生长激素的氨基酸序列如下：1         FPTIPLSRLF DNAMLRARRL YQLAYDTYQE FEEAYILKEQ KYSFLQNPQT SLCFSESIPT61        PSNRVKTQQK SNLELLRISL LLIQSWLEPV QLLRSVFANS LVYGASDSNV YRHLKDLEEG121       IQTLMWRLED GSPRTGQIFN QSYSKFDTKS HNDDALLKNY GLLYCFRKDM DKVETFLRIV181       QCRSVEGSCG F 。