[发明专利]人胚源性神经干细胞分化为神经细胞的正常成人脑脊液诱导方法

摘要

本发明提出一种人胚源性神经干细胞分化为神经细胞的正常成人脑脊液诱导方法，其包括如下步骤：原代细胞的分离和培养；克隆诱导分化；免疫细胞化学染色；以及细胞计数。本发明应用正常成人脑脊液培养基将原代培养的人胚来源的神经干细胞分化诱导为各类神经细胞，在分化的不同时间对分化的细胞进行免疫细胞化学染色，计算各类神经细胞的比例。其结果表明，在最早期的分化当中神经元占的比例较高，正常成人脑脊液能诱导人胚来源的神经干细胞分化成神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞，与在胎牛血清中的分化相比星型胶质细胞比例增多，而其他类型细胞比例无显著性差异。神经干细胞在脑脊液中可以存活和分化，为神经干细胞的移植治疗提供理论依据。

主权项

一种人胚源性神经干细胞分化为神经细胞的正常成人脑脊液诱导方法，其包括如下步骤：S1：原代细胞的分离和培养：取胚龄13周水囊引产的新鲜人胚胎，无菌条件下分离出胚胎大脑皮层组织，剥除脑膜及表面血管，在PBS液中漂洗3次，用细吸管反复吹打组织碎块至完全散开，离心洗涤后吹打制成细胞悬液，经100目不锈钢滤网过滤，制成单细胞悬液，加入含B 27(1∶50)(GibcoBRL)和EGF(Serotec.)20ng/ml、bFGF(Chemicon)20ng/ml的DMEM/F12(1∶1)(GibcoBRL)无血清培养基，台盼蓝染色计数活细胞，调整细胞浓度为1×105/ml，将原代细胞种植于25cm2培养瓶(8ml细胞悬液/瓶)，37℃、5％CO2条件下静置培养；S2：克隆诱导分化：选取单细胞形成的克隆球，机械分离成单细胞悬液，种植于多个培养皿中，置入多聚赖氨酸包被的玻片，用含有正常成人脑脊液培养基(DMEM/F12+B27+30％脑脊液)培养，观察其生长分化情况，分别于1、3、7、14、21d行免疫细胞化学染色检测；S3：免疫细胞化学染色：将贴附有细胞的玻片取出用4％多聚甲醛固定，用SABC组织化学染色试剂盒分别检测神经微丝(neurofilament，NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、Galc在分化细胞中的表达；以及S4细胞计数：免疫细胞化学染色NF(+)的细胞代表神经元，GFAP(+)细胞代表星型胶质细胞，Galc(+)细胞代表少突胶质细胞，苏木精复染成蓝色的细胞代表总细胞数；倒置显微镜下(20×)对分化的细胞随机选择6个独立视野计数NF(+)的细胞数、GFAP(+)细胞数、Galc(+)细胞数及总细胞数，计算各系细胞比例并求其平均数。