[发明专利]一种磁珠富集法开发菜豆SSR引物的制备方法

摘要

本发明公开了一种磁珠富集法开发菜豆SSR引物的制备方法，其步骤：首先用MseI对菜豆基因组DNA进行酶切，利用AFLP扩增原理创建文库；第二，基因组PCR文库与生物素标记的重复序列探针进行杂交；第三，通过对杂交混合液加入到表面包被有一层链霉亲和素的磁珠中；第四，将洗脱液纯化的微卫星DNA作为DNA模板，用PCR扩增方法使得微卫星DNA片断得到放大；第五，将纯化后的PCR扩增产物连接到T载体上克隆，得到插入片断的DNA序列；第六，重复核心区两侧设计引物，进行引物筛选，得到有效的微卫星位点。且简单易行，引物效率高，从48对引物中得到了20对有效的引物，为大批量的开发SSR引物提供保障。

主权项

一种磁珠富集法开发菜豆SSR引物的制备方法，包括下列步骤：A、菜豆基因组DNA的提取：选取菜豆品种，按照常规的栽培管理和肥水措施种植，小苗长出5‑6片叶子，取嫩叶0.4克利用CTAB法提取基因组DNA；B、提取基因组DNA浓度的检测：提取基因组DNA的浓度用分光光度计检测，进行SSR引物开发的基因组DNA浓度要达到100ng‑1ug/ul；C、酶切基因组DNA：用Mse I对菜豆基因组DNA进行酶切，利用AFLP扩增原理在酶切片断的两端加上单链寡核苷酸接头，并用与接头配套的接头引物进行PCR扩增放大，创建基因组PCR文库，对文库进行纯化；D、Mse I酶切片段加接头：酶切DNA产物用Mse I接头：接头序列Oligo‑MseI A5‑TACTCAGGACTCAT‑3’，Oligo‑Mse I B 5‑GACGATGAGTCCTGAG‑3’加T4 DNAligase进行连接，混匀后，置16℃恒温水浴锅温浴过夜，然后放在4℃冰箱中保存备用；E、酶切连接的PCR预扩增：以步骤D酶切连接好的产物为模板，以MseI‑N：5’‑GATGAGTCCTGAGTAAN‑3’为引物进行PCR扩增，反应条件：第一步1个循环，94℃5min，第二步18个循环，94℃1min，53℃1min，72℃1min，第三步1个循环72℃10min，4℃保存，反应产物使用1％W/V琼脂糖电泳检测；F、PCR预扩增产物与生物素探针杂交：在66‑70℃下使得PCR文库与所选用的生物素标记的重复序列探针进行杂交；磁珠的表面包被有一层链霉亲和素，生物素标记的探针与含重复序列单元的DNA片断杂交结合以后，通过洗涤过程并用磁场固定，在变性条件下含重复序列的微卫星DNA被TE缓冲液洗脱；将洗脱液纯化以后作为DNA模板；杂交体系总体积为100μL，总共平行配制2管分装，进行杂交，在PCR仪上进行，反应程序为95℃变性5min；杂交66‑70℃下保持1‑2h，杂交反应完毕后往反应体系中加入300μL TEN100溶液，混匀后置于4℃保存备用，将加有300μL TEN100的杂交混合液加入到经过预处理的磁珠中，室温上放置30min，然后对杂交的磁珠进行洗脱，SDS溶液于室温下洗涤磁珠3次，每次5min，三次漂洗后再用400μL预热至55℃的0.2×SSC+0.1％SDS溶液洗涤1次，加入50μL TE8.0，用移液器吸打均匀，然后于95℃下水浴5min，冻存于‑20℃，取得目的DNA片段，以洗脱产物为底物，以MseI‑N为引物，用纯化后的5μL目的DNA洗脱片段用于PCR扩增，扩增条件与上面的PCR预扩增条件一致，扩增30个循环；G、连接转化克隆：将纯化后的PCR扩增产物连接到T载体上进行克隆，操作依照pMD 18‑T载体连接，连接反应体系为10μL，连接条件为16℃1hr，于‑70℃冰箱中取出一管感受态细胞，置于冰浴中融化，加入5μL连接产物，冰浴30min，冰浴结束后42℃热激90sec，再冰浴5min，然后加入1mL预冷的液体LB培养基，于37℃的摇床上复苏培养45min，复苏培养结束后于4℃10000rpm离心1min，以沉淀细胞；去上清，剩余200‑300μL培养基重悬细胞，往每个LB平板上加入4μLIPTG和40μL X‑gal，涂布均匀，每100μL菌液涂一个平板，待液体吸收完毕后，将平板倒置于37℃过夜；H、阳性克隆的挑取、培养、筛选和测序：挑选阳性克隆用载体通用引物测序，得到的插入片断的DNA序列，挑选出微卫星DNA序列，将培养好的平板在4℃放置，使菌落显色，用无菌牙签挑取白色克隆到500μL液体培养基中，37℃摇床上以200rmp转速培养过夜，4℃保存菌液；取1μL菌液用于PCR模板，扩增条件为：95℃5min；94℃40s；54℃30s；72℃1min；循环30次；72℃7min。取2μL产物于1％W/V琼脂糖凝胶上电泳，用全自动凝胶成像分析系统记录电泳结果；将含有插入片段并且大小的阳性克隆取一半菌液测序，另一半加入20％V/V菌甘油，混匀后于‑70℃冻存备份，用M13+通用引物测序，测序在ABI 3730XL DNA Sequencer上进行，所用反应试剂为ABI PRISM BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit，每反应的有效长度达700‑800bp，用M13引物从另外一段进行测序，并将正反向测序结果进行拼接；J、序列分析和微卫星位点的分类与设计：用软件SSRHunter从得到的序列中查找出含有重复单元的微卫星序列，测序，根据Weber提出的标准将微卫星分为3类：完美型，指没有中断的或附近没有其它种类重复序列的重复序列；非完美型，指2个或以上的同种重复序列被3个碱基以下的非重复序列所间隔；复合型，指一种重复序列与其它种类的重复序列被3个以下的非重复序列所间隔，将挑选出的微卫星序列去除载体序列，在序列上标记出Mse I接头的位置，再用引物设计软件Primer Premier 5.0在两端接头和核心重复区域之间设计正向和反向PCR扩增引物，用于相应位点的PCR扩增；K、微卫星引物检验：对每个位点引物的有效性合多态性进行筛选，得到有效的微卫星位点，挑选两个DNA模板对所有合成的引物进行PCR扩增，退火温度使用设计引物时的默认温度为50‑62℃，微卫星PCR扩增反应体系为15μL，扩增条件为：94℃5min；94℃40s，Tm 30s，72℃40s，35cycles；72℃7min，PCR扩增产物按照5：1以体积比例加入上样缓冲液，95℃变性5分钟后置于冰上，在8％变性聚丙烯酰胺凝胶上加样检测，在上样的同时往其中一个加样孔加入0.1gPBR322/Msp I Marker，正常扩增的引物对用挑选出的DNA模板在退火50‑62℃下进行PCR扩增的结果在聚丙烯酰胺胶上电泳的结果读带，选择带型清晰，至少有两个或两个以上等位基因的引物筛选出来。