[发明专利]一种油菜种皮中不同来源ANS基因表达的快速检测方法及运用

摘要

一种油菜种皮中不同来源ANS基因表达的快速检测方法。本发明通过克隆和分析油菜3个基本种(白菜：染色体组为AA,2n=20；甘蓝：染色体组为CC,2n=18；黑芥：染色体组为BB,2n=16)和3个异源四倍体(芥菜型油菜：染色体组为AABB,2n=36；甘蓝型油菜：染色体组为AACC,2n=38；埃塞俄比亚芥：染色体组为BBCC,2n=34)ANS基因的序列，根据A、B和C染色体组来源的ANS基因的核苷酸多态性位点，设计能够区分A、B和C染色体组来源的ANS基因的特异的引物，结合RT-PCR，对不同染色体组型油菜的种皮中表达的ANS基因类型进行鉴定。这一方法对进一步研究油菜籽种皮颜色形成的分子调控机理，加快黄籽油菜品种选育的进程有积极意义，同时也为油菜ANS基因的来源检测提供了新的方法。

主权项

一种油菜种皮中不同来源ANS基因表达的快速检测方法，其特征是，包括步骤：（1）根据油菜三个基本种(白菜、甘蓝、黑芥)和三个异源四倍体(芥菜型油菜、甘蓝型油菜、埃塞俄比亚芥)ANS基因的序列比对分析，寻找核苷酸多态性位点；白菜(Brassica campestris, AA, 2n=20)为A染色体组；黑芥(Brassica nigra，BB, 2n=16) 为B染色体组；甘蓝(Brassica oleracea, CC, 2n=18) 为C染色体组；（2）通过比较A、B、C染色体组中ANS基因的多态性，利用引物设计软件分别设计A、B、C染色体组的特异引物；通过PCR条件的优化，确定特异扩增A、B、C染色体组ANS基因的引物；所述特异扩增A染色体组ANS基因的引物为：上游引物5'‑TTAGCGAAAAGCGGGATCAGC‑3'，下游引物5'‑CCACGGGCAAACCGAAGAA‑3', 该引物对只能使来自A染色体组的ANS基因有扩增产物，PCR产物大小为296bp；所述特异扩增B染色体组ANS基因的引物为：上游引物 5'‑TTAGCAAAGAGCGGAATCGAA‑3'，下游引物5'‑CCACGGGCAAACCGAAGAA‑3'，该引物对只能使来自B染色体组的ANS基因有扩增产物，PCR产物大小为296bp; 所述特异扩增C染色体组ANS基因的引物为：上游引物 5'‑TAGCAATGGGAAGTTTAAGAGTA‑3'，下游引物5'‑GTGGTTCATAGAGCATATCTCG‑3'，该引物对只能使来自C染色体组的ANS基因有扩增产物，PCR产物大小为452bp；（3）从不同类型油菜的授粉后10‑30天的种皮中分离总RNA，分别反转录后，进行特异引物PCR扩增；（4）PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭为染料，电泳后用凝胶分析系统进行分析，根据引物特异性与电泳带的有无，确定表达的ANS基因是来自哪个染色体组；如果来自A染色体组ANS基因的特异引物扩增，电泳分离的扩增片段大小约为290bp，说明表达的ANS基因是来自A染色体组;如果来自B染色体组ANS基因的特异引物扩增，电泳分离的扩增片段大小约为290bp，说明表达的ANS基因是来自B染色体组;如果来自C染色体组ANS基因的特异引物扩增，电泳分离的扩增片段大小约为450bp，说明表达的ANS基因是来自C染色体组。