[发明专利]以MyD88TIR二聚化为靶点的抗炎抑制剂筛选模型及应用

摘要

本发明涉及一种以MyD88TIR二聚化为靶点的抗炎抑制剂筛选模型及应用，其特征在于：将MyD88TIR分别与一荧光供体和荧光受体蛋白基因GFP/RFP构建融合蛋白质粒，转染哺乳动物细胞，建立双阳性表达的细胞株。可以检测到FRET现象；当培养基中存在MyD88TIR二聚化抑制物时，提示了依赖双阳性表达GFP-MyD88-TIR和RFP-MyD88-TIR的细胞株，经体外结合分析，可以进一步确定抑制物是否直接阻断了TIR的相互作用。结合真核细胞的荧光FRET阻断结果和原核表达的重组蛋白相互作用分析，可确定MyD88TIR二聚化的抑制物。利用该模型可以对商品化的小分子库、自行制备的天然产物组分或各种化学合成物、修饰物进行广泛的筛选，从中获得有效的MyD88二聚化的抑制性化合物，参与对MyD88信号通路依赖的慢性炎症、自身免疫性疾病的药物筛选。

主权项

以MyD88TIR二聚化为靶点的抗炎抑制剂筛选模型，其特征在于：可以将MyD88分子的TIR结构域(以下称MyD88 TIR)分别与一荧光供体和荧光受体蛋白基因GFP/RFP(或CFP/YFP)构建融合蛋白质粒，转染哺乳动物细胞，建立双阳性表达的细胞株。如两种生物大分子(荧光供体分子和荧光受体分子)的距离足够近，即小于10nm，为两蛋白分子直接相互作用的距离，在荧光供体的激发光照射下可以产生荧光受体的发射光信号，即发生荧光共振能量转移(FRET)；如果荧光供体分子和荧光受体分子的结合受到阻碍，则FRET受到影响。其具体步骤如下：首先构建绿色荧光蛋白与MyD88TIR的融合蛋白真核表达质粒(以下简称GFP‑MyD88 TIR)和红色荧光蛋白与MyD88 TIR的融合蛋白真核表达质粒(以下简称RFP‑MyD88 TIR)；再将二者共同转染哺乳动物细胞(如HeLa)，并建立双阳性表达的细胞株。如果培养条件中不存在小分子抑制物，MyD88 TIR发生二聚化，488nm激发光(蓝光)照射下GFP‑MyD88 TIR发出的绿色荧光会有一部分作为RFP‑MyD88 TIR的激发光被吸收，进而发出红色荧光，绿荧光减弱，即FRET发生；而如果培养条件中有小分子抑制物存在的话，MyD88 TIR无法发生二聚化，488nm激发光(蓝光)照射下GFP‑MyD88 TIR发出的绿色荧光不会转移给RFP‑MyD88 TIR，无红色荧光发出，产生正常的绿色荧光。细胞培养和药物筛选可结合高通量筛选仪及荧光值的相关函数运算；对于上述基于荧光信号变化的筛选模型认定阳性(即，对FRET有影响)的化合物，还需利用原核表达并纯化的重组蛋白，进行体外蛋白质‑蛋白质相互作用的验证分析：当培养细胞中FRET现象被某种添加的化合物阻断了，尚不能得出是这种化合物直接阻断了MyD88 TIR的二聚化结论，还是这种化合物引发了某种细胞内信号级联，间接地影响了MyD88 TIR的二聚化；因此利用一个His‑MyD88TIR和GST‑MyD88 TIR重组蛋白体外相互作用分析加以验证；具体步骤如下：在非变性缓冲液中，可以加入上述荧光筛选模型认为有效阻断MyD88 TIR二聚化的化合物，如果化合物能直接阻断MyD88 TIR的二聚化，则His‑MyD88 TIR体外条件下不能正常结合GST‑MyD88 TIR，进行His‑MyD88 TIR结合物(Pull‑down产物)的western blot分析，不能检测到GST抗体识别的信号；如果化合物不能直接阻断MyD88 TIR二聚化，His‑MyD88 TIR体外条件下能够正常结合GST‑MyD88 TIR，进行His‑MyD88 TIR结合物(Pull‑down产物)的western blot分析，则可以检测到GST抗体识别的信号；经此验证模型，确切的MyD88 TIR二聚化抑制剂就可得以判定。