[发明专利]利用羔羊超排卵母细胞生产体外胚胎的方法

摘要

本发明公开了一种羔羊超排卵母细胞生产体外胚胎的方法，通过以下技术方案实现的：将从羔羊体内采集到的卵母细胞在成熟液中进行体外培养成熟为卵子，再经体外受精和培养，使卵子发育为胚胎，即可将成活的胚胎移植到代孕母羊体内进行繁育。与现有技术相比，本发明特别是利用幼年羔羊超排处理后采集的卵母细胞进行体外胚胎生产，具有卵母细胞采集数量多、胚胎生产效率高、培育羔羊后代所需时间短等优点，因而在大规模体外胚胎生产应用中具有优势。

主权项

一种利用羔羊超排卵母细胞生产体外胚胎的方法，其特征在于：通过以下过程实现：成熟液配制：在M199培养基原液中加入： 8～12µg/mL FSH(促卵泡素)、8～12µg/mL LH (促黄体素)、0.5～1.5µg/mL E2 （雌激素）、0.05～0.15mmol/L β‑巯基乙醇和10～20%ESS（发情母羊血清），培养液在使用前制作成40～60μL/滴的成熟液微滴，在培养箱中平衡1～3h；卵母细胞培养：将采集到的COCs(卵丘‑卵母细胞复合体)移入成熟液微滴中，每滴成熟液微滴中移入10～20枚卵母细胞，在38～39℃、4~6% CO2 、饱和湿度环境下培养22～26h，COCs中的卵母细胞成熟为卵子；受精液配配制：在SOF(输卵管合成液)中加入：0.1～0.2 μmol/L青霉胺（Penicillamine）、0.1～0.2 μmol/L亚牛磺酸（Hypotaurine）、5～10 μg/mL肝素（Heparin）和2～10% ESS（发情母羊血清），在受精前1～2h，在培养皿或培养板中制做受精液滴，每滴40～60μL；精液处理：取新鲜或者解冻后的精液，稀释成4×106 ～6×106 /mL的精子稀释液，在所述的每个受精液滴中移入8～12μL精子稀释液，将受精液滴连同培养皿或培养板一同放入CO2培养箱中平衡2h以上；体外受精：将成熟液中的成熟卵子按每个受精液滴中30～50个成熟卵子的比例移入受精液滴中，然后放入在38～39℃、4～6% CO2 、饱和湿度环境的培养箱中进行体外受精并培养18～24h；胚胎发育液为配制：在SOF 中加入 1～3% BME(EAA) （必需氨基酸）、1～3% MEM(NEAA)（非必需氨基酸）、0.5～5% BSA（胎牛血清）、0.05～0.15 mmol/mL Glutamine(谷氨酰胺) 和0.4～6 mg/mL Mys‑Inositol（肌醇），将胚胎发育液按照50‑100μl的容积在培养板或培养皿上做成液滴状，在培养箱中平衡1‑3h；受精卵子培养：精子与卵子受精培养18～24h后，除去受精卵子周围的颗粒细胞和附着的精子，以15‑40枚/滴的密度放入胚胎发育液滴中，在饱和湿度的培养箱中，38～39℃、4～6%CO2下进行体外培养6‑8天。