[发明专利]一种高效的烟草花粉离体液体培养的方法

摘要

本发明涉及一种高效的烟草花粉离体液体培养的方法。该方法的操作步骤主要是在无菌条件下对经过消毒处理后的花药在B5-13液体培养的作用下通过碾压快速释放大量花粉，低速离心收集花粉，先在含有50-70mg/L浓度的秋水仙素的NLN-16液体培养基中32℃静置避光进行加倍处理，再在NLN-13液体培养基中25℃进行静置诱胚避光培养，待肉眼可见胚后置于25℃恒温摇床上振荡暗培养7-10d，达到子叶期的胚即可转入固体培养基上进行继代培养，移栽季节幼苗经炼苗后即可移栽入大田开花套袋结实。该方法具有构思新颖、设计巧妙，科学实用、高效稳定、产量大、能大大缩短烟草育种周期等特点。

主权项

一种高效烟草花粉离体液体培养的方法，其特征在于依次按以下操作步骤进行：(1)、花蕾采取保存：于晴天在烟草植株主花序或侧花序上采取无病虫、生长良好的适龄花蕾一株或多株，将取好的花蕾迅速用冰盒保存；(2)、花药消毒：将步骤1中保存在冰盒内的花蕾在超净工作台上剥取花蕾中的花药，然后将剥取的花药用无菌纱布或无菌市售丝袜包裹浸入70 75％浓度的酒精中消毒10 15s，快速取出立即浸入饱和Ca(ClO)2溶液中消毒8min或8min以上，在消毒过程中轻轻晃动烧杯使其消毒充分，最后用无菌水冲洗多次；(3)、花粉获取：取出经步骤2消毒好的花药放入圆底试管中，加入1 3ml的B5 13液体培养，再加入1 2ml用于软化花药壁的酶液，轻轻碾成匀浆，倒入装有300 400目双层尼龙膜的漏斗中过滤，并用离心管收集滤液，向装有滤液的离心管中加入B5 13液体培养至设定刻度，离心处理后去上清液，再加入B5 13液体培养重新悬浮，二次离心后再去上清液；(4)、花粉加倍与培养：向步骤3中两次离心后得到的花粉中加入含有浓度为50 70mg/L秋水仙素的NLN 16液体培养基，使其重新悬浮后分装到培养皿或玻璃三角瓶中，密封好后静置于温度为30 33℃的避光环境下培养48 72h，对花粉进行加倍处理；然后将加倍处理后的花粉转移到离心管，离心处理后去上清液，加入NLN 13液体培养基，分装入培养皿中，再次静置于低温环境下暗培养14 21d；(5)、幼胚培养：待步骤4中装入加倍花粉的培养皿内出现肉眼可见胚时，便将其置于23 26℃恒温摇床上，振荡暗培养7 10d，并对其进行定时观察，将达到子叶期的胚转入MS固体培养基上进行继代培养，其温度为25 27℃，每日光照8 10h；(6)、烟苗移栽：待烟苗健壮且有8 9片真叶、10 12cm高时，敞开瓶口炼苗2 3d，然后将烟苗根系上附带的培养基彻底清洗掉，便移栽到温室的花钵中假植或者于烟苗移栽季节直接栽种于大田中。