[发明专利]吡咯并喹呤醌与氨基酸神经递质作用的研究方法

摘要

吡咯并喹呤醌与氨基酸神经递质作用的研究方法，属于生物分析技术领域。本发明采用HPLC方法研究吡咯并喹呤醌PQQ与Gly、Dser、Glu、Asp和GABA5种神经递质的反应，通过测定不同温度、不同时间点反应剩余PQQ的浓度，研究PQQ与5种神经递质的反应动力学、速率常数和活化能数据，考察PQQ与5种神经递质的反应能力。本发明建立的HPLC方法经方法学研究，能够用于PQQ与神经递质氨基酸反应的研究，检测限为0.05μM。文献报道的毛细管电泳检测PQQ与甘氨酸反应，检测限为0.1–0.2μM。反应活化能的大小决定了反应的难易程度，活化能越高，反应越难进行。EGABA＞EGlu＞EAsp＞EDser＞EGly，提高温度有利于反应的快速进行。

主权项

1.吡咯并喹呤醌PQQ与氨基酸神经递质作用的研究方法，其特征在于采用HPLC方法研究PQQ与Gly、Dser、Glu、Asp和GABA 5种神经递质的反应，通过测定不同温度、不同时间点反应剩余PQQ的浓度，研究PQQ与5种神经递质的反应动力学、速率常数和活化能数据，考察PQQ与5种神经递质的反应能力；   （1）HPLC分析条件采用C18反相色谱柱，型号：Amethyst C18-P,5μm,4.6×250mm，对流动相进行了改进，A：乙腈；B：20mM磷酸二氢钾、10mM四丁基溴化铵、含0.1%十二烷基磺酸钠SDS、用磷酸调pH为4.0-6.0；A/B 的v/v为35/65，流速0.8mL/min，检测波长249nm；（2）波长的确定称取一定量的PQQ、Gly、Dser、Glu、Asp、GABA，分别用pH 7.0磷酸盐缓冲液溶解，配制成PQQ溶液浓度为1mM，各氨基酸溶液浓度为25mM；PQQ溶液与各氨基酸溶液分别按v/v为1:1混合，避光，于37℃水浴孵育24h，用pH 7.0的磷酸盐缓冲液作空白进行紫外光谱扫描，紫外光谱图显示249nm处各样本紫外吸收较高；选择249nm 作为检测波长；（3）pH值的影响选择用分离度对pH作图，pH为4.0-6.0分离度较高，PQQ与5种OXAZOLE反应物达到较好的分离；所述5种OXAZOLE：OX1为PQQ-Gly，OX2为PQQ-Dser，OX3为PQQ- Glu，OX4为PQQ- Asp，OX5为PQQ- GABA；（4）缓冲液中添加SDS对分离的影响在缓冲液中分别添加0.05%、0.1%、0.15%、0.2%SDS试验，当SDS含量为0.1%时，PQQ与5种OXAZOLE都能达到基线分离；（5）线性、精确度和检测限测定准确称取一定量的PQQ，用pH 7.0磷酸盐缓冲液配制成浓度为25mM的溶液，用相同缓冲液稀释成0.25~2.5mM不同浓度的标准溶液，分别进样，用积分面积对样品浓度作图，得回归方程为A = 87503294C + 345390，R² = 0.9997，在0.25~2.5mM范围内成线性关系；在确定的色谱条件下于同一天内连续进样6次，根据峰面积计算所得相对标准偏差为2.4%，保留时间的相对标准偏差为0.39%，最小检出量为2.0ng；（6）PQQ与5种氨基酸反应剩余PQQ浓度的测定将PQQ溶液分别与5种氨基酸溶液按v/v为1:1混合反应，避光，分别置于37、50℃孵育，于0.5、1、2.5、5、7.5、10、24h各时间点抽取反应液10μL，注入液相色谱仪，HPLC分析，根据PQQ的峰面积和线性方程计算游离PQQ的浓度；（7）PQQ与5种氨基酸反应速率常数和反应级数的测定用各温度、各时间点测定的实验数据按下列公式计算各级反应速率常数：一级反应，n=1：，二级反应，n=2： a = b：，二级反应，n=2： a ≠ b：，三级反应，n=3：，零级反应，n=0：x = k₀t，式中：a为反应物A的起始浓度，b为反应物B的起始浓度，k为反应速率常数，t为时间，x为t时刻生成物浓度，n为反应级数；用各温度、各时间点的实验数据按上式计算零级、一级、二级、三级反应的速率常数，以速率常数方差最小方法确定反应级数为n = 1，即PQQ与5种氨基酸反应为一级反应；同时计算获得各温度下的速率常数k，并计算出平均速率常数；（8）反应活化能的测定根据阿仑尼乌斯公式计算各反应的活化能：式中：E_a为反应活化能，T为绝对温度，R为里德堡常数，R=8.314 J/mol·K，由上式计算出反应活化能；（9）半衰期的测定半衰期t_1/2为反应物消耗一半所需时间，各级反应时间的半衰期可按下列公式计算：一级反应：t_1/2=，二级反应：a = b：t_1/2 =，二级反应：a ≠ b：t_1/2 (A) ≠ t_1/2 (B)，                   三级反应： a = b = c：t_1/2=，零级反应：t_1/2=，根据式，计算得到不同反应温度下的半衰期t_1/2。