[发明专利]河流环境样品中微生物DNA的简易提取

摘要

一种河流环境样品中微生物DNA的简易提取。本发明方法将河流环境样品分为水样和底泥样品两部分，分别对其中的微生物DNA进行提取，同时该方法也可以作为其中任何一种环境样品的单独提取方法。利用液氮反复冻融法、SDS法、溶菌酶法等方法组合，能够使环境样品中微生物细胞充分裂解，DNA完全释放，经PCR-DGGE技术进行细菌多样性分析后表明，该提取方法能够有效地反映河流环境样品中微生物的完整性和多样性。

主权项

河流环境样品中微生物DNA的简易提取，其特征在于该方法是将河流环境样品分为水样和底泥样品两部分，分别对其进行微生物DNA提取，同时该方法也可以作为其中任何一种环境样品的单独提取方法，具体步骤是：第1、河流环境样品中微生物细胞裂解第1.1、河流水样中微生物细胞裂解第1.1.1、河流水样的富集处理取2L水样经0.22um灭菌膜过滤，收集滤膜，将其剪碎置于10mL无菌离心管中，加入2mL无菌水，漩涡震荡5分钟，8000rpm离心10分钟，得到富集的上清液；第1.1.2、河流水样中微生物细胞裂解量取2mL第1.1.1、步处理后的水样于10mL无菌离心管中，加入2mL DNA Extraction Buffer，DNA Extraction Buffer包括100mmol Tris‑HCl、100mmol Na2 EDTA、1.5mol NaCl和质量浓度为1%的PVP30000；同时向10mL离心管中加入0.5mL 50mg/mL的溶菌酶，漩涡震荡直至混匀；37℃水浴2h，加入1mL质量浓度为20%的SDS，65℃水浴30分钟，中间轻轻摇晃离心管2‑3次，8000rpm离心15分钟，取上清；第1.2、底泥样品中微生物细胞裂解第1.2.1、称取1g底泥样品于10mL无菌离心管中，加入2mL DNA Extraction Buffer，漩涡震荡10分钟，加入1mL质量浓度为20%的SDS，漩涡充分；将离心管置于液氮中30s，再置于65℃水浴20分钟；重复此操作1‑2次；取出样品，8000rpm离心15分钟；将上清液转移置另一10mL无菌离心管中，待用；第1.2.2、向第1.2.1步的沉淀物中加入2mL DNA Extraction Buffer和0.5ml 50mg/mL的溶菌酶，漩涡震荡直至混匀；37℃水浴2h，加入1mL质量浓度为20%的SDS，65℃水浴30分钟,中间轻轻摇晃离心管2‑3次，8000rpm离心15分钟，将上清液与第1.2.1步的上清液混合；第2、粗DNA溶液的获得向第1步得到的河流水样和底泥样品的微生物细胞裂解上清液中，分别加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇=25:24:1的混合液，上下颠倒抽提；12000rpm离心10分钟，取上清；用氯仿：异戊醇=24:1的混合液再抽提一次，12000rpm离心10分钟，取上清液；第3、微生物DNA的获得向第2步抽提后的上清液中分别加入0.1倍体积的NaAc 和0.6倍体积的异丙醇，‑20℃放置1h；12000rpm离心20分钟，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀1‑2次，自然风干，用50μL TE溶解即环境样品微生物DNA，TE溶液包括pH 8.0的10 mmol/L Tris‑HCl和pH 8. 0的1 mmol/L EDTA。