[发明专利]利用酵母甘露糖异构酶基因获得转基因拟南芥植物的方法

摘要

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种利用真核生物酵母甘露糖异构酶基因PMI获得转基因拟南芥的方法。本发明的特征是，以酿酒酵母磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因为筛选标记，通过农杆菌介导的转化方法将PMI基因和其它基因一起导入受体拟南芥，对转化后的拟南芥种子在含甘露糖的培养基上进行筛选，通过PCR检测和RT-PCR检测，得到转基因植株。本发明的优点是在植物转化及筛选过程中不需要添加抗生素和除草剂，并且转基因植物本身也不含有抗生素基因或抗除草剂基因，对环境和人体安全，消除人们对转基因生物安全的在筛选标记基因方面的担心。

主权项

一种利用酿酒酵母磷酸甘露糖异构酶基因获得转基因拟南芥植物的方法，其特征在于，以酿酒酵母甘露糖异构酶PMI基因作为安全的转基因筛选标记，通过农杆菌介导的遗传转化方法将所述的PMI基因导入受体拟南芥中，利用甘露糖代替抗生素或除草剂作为筛选剂，将转化后的拟南芥种子在含有甘露糖的培养基上进行筛选：其步骤如下：1)利用XhoI限制性内切酶对质粒pCAMBIA1303进行酶切，切除其中的潮霉素基因hpt；2)设计如下一对特异引物，其核苷酸序列如下所示：正向引物P1：5′‑GCCTCGAGCCAGAAAATTTTAAAAACATG‑3′，反向引物P2：5′‑GCCTCGAGAGAAAGAAAGCTAATTTGG‑3′；扩增酿酒酵母甘露糖异构酶PMI基因，得到如序列表SEQ ID NO：1所示的DNA片段，片段长度为1455bp；3)将步骤2)得到的SEQ ID NO：1所示的DNA片段连接到到步骤1)所述的质粒pCAMBIA1303中，得到重组质粒pPMI；4)将重组质粒pPMI转化根癌农杆菌，得到含有pPMI质粒的根癌农杆菌，将所述的根癌农杆菌培养于YEP培养基中，得到转化菌株5)使用水培方法，将拟南芥CS3081于23℃，8h短日照下培养，待主花序为3～10cm长时，从其基部剪去主花序，促进侧枝生长，于7天后用于转化；6)将步骤5)的拟南芥花序浸泡到步骤4)的农杆菌菌液中，使农杆菌菌液的浓度保持至OD600＝1.0，处理时间为10s，在23℃16h长日照的培养箱中培养，两周之后将转基因植株移栽至水培培养液中，23℃，8h短日照下培养；收获被转化拟南芥植株上的所有种子；7)在含有1g/L的甘露糖筛选培养基上，播种步骤6)的拟南芥种子，得到转基因植株；8)采用PCR和RT‑PCR方法检测转基因植物；其中步骤7)所述的甘露糖筛选培养基的配方如下：MS基本培养基，附加0.4‑1g/L的甘露糖和0.4％Phytagel，pH5.8；步骤8)所述方法如下：设计如下一对特异引物，其核苷酸序列如下所示：正向引物P1：5′‑GCCTCGAGCCAGAAAATTTTAAAAACATG‑3′，反向引物P2：5′‑GCCTCGAGAGAAAGAAAGCTAATTTGG‑3′；PCR扩增所述的PMI基因的DNA片段，该片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其片段长度为1455bp。