[发明专利]一种利用组培快速转育质体转基因植株的方法

摘要

本发明将转基因单株与待转育的植株在无菌培养条件下切成小段，然后愈伤口处对接，待对接处长出愈伤团，两个材料细胞质中的质体相互转移，通过组织培育和在选择压条件下进行筛选，得到细胞质含有质体转基因成分而细胞核为被转化的材料植株。利用此方法可以快速进行转育。与传统方法相比，可提高效率5倍以上，大大节约成本和人力资源。

主权项

一种利用组培快速转育质体转基因植株的方法，其特征在于依次通过下列步骤实现：1）取转基因质体材料与待转育材料的种子浸泡24h后，依次经清水冲洗2次、质量比浓度为95%的乙醇冲洗1min 、无菌水清洗2‑3次、质量比浓度为0.1%的升汞漂洗15min，其间不时摇动、无菌水清洗4次后，接种于MS培养基上，在培养箱中无菌培养，取培养8‑10d的幼苗备用；MS培养基配方：MS粉4.4g/L+蔗糖20g/L+冷凝胶2.6g/L2）待种子发芽生长到下胚轴伸长大约10cm左右，将转基因叶绿体材料种子下胚轴切成5mm切段，将待转育材料下胚轴切成15mm切段，然后将两种切段切口处对接，存放于诱导脱分化培养基中；脱分化培养基配方：MS盐4.41g/L+2,4‑D 1mg/L+6‑BA 1mg/L+蔗糖30g/L + 冷凝胶2.6g/L3）伤口处出现愈伤组织的分化后，将转基因材料下胚轴和待转育材料下胚轴对接切段转移至分化培养基上；分化培养基配方：MS盐4.41g/L +6‑BA4mg/L+ZT 2mg/L+AgNO3 5mg/L+蔗糖 30g/L +冷凝胶2.6g/L4）待伤口处产生绿色和白色致密的愈伤组织后，再转移到分化芽培养基上，此时两种切段的愈伤组织结合在一起生长，根据质体中的选择性标记在分化芽培养基上加入相对应的筛选物质，淘汰未含有转基因的质体细胞，培养两周；分化芽培养基配方：MS盐4.41g/L +6‑BA 3mg/L+ZT 2mg/L +蔗糖 30g/L +冷凝胶2.6g/L+筛选压5）培养基两周更换一次，组织分化出的类似嫩叶的组织1cm左右高时，转移至分化茎培养基中；分化茎培养基配方：MS盐4.41g/L +6‑BA 0.005mg/L +蔗糖 30g/L +冷凝胶2.6g/L+筛选压6）在分化茎培养基上外植体逐渐生长出完整的小植株，待其茎长出2‑3片叶、3‑4条须根时，打开培养罐，使小植株慢慢适应外界环境，2‑3天后，将植株移出，用清水将根部培养基洗净，移栽至盛有营养土的盆钵中常规培养；7）对长出的幼苗，根据转基因叶绿体材料中的抗性基因，使用对应的物质对培育出的植株进行筛选，如抗性基因为抗草丁磷除草剂基因，则筛选物质为草丁磷，保留抗性单株；8）取植株叶片提取叶绿体和细胞核DNA，进行分子鉴定，若材料中的细胞质指纹图谱中含有抗性基因片段，并且核遗传物质指纹图谱与待转育的材料指纹图谱相符，即为转育成功的材料，再利用田间鉴定进行进一步确认；上述方法步骤1‑6中外植体的培养条件为：光照16h和黑暗8h培养；培养基两周换一次；步骤4所述的选择性标记是指抗basta或抗kan。