[发明专利]一种制备流感病毒裂解疫苗的新工艺

摘要

本发明涉及一种制备流感病毒裂解疫苗的新工艺，步骤如下：(1)、病毒接种与培养：于鸡胚尿囊腔接种稀释至病毒量2.0-6.0LgEID50/ml的工作种子批毒种，置33～35℃培养48～72小时；(2)、病毒收获、病毒灭活、病毒收获液浓缩；(3)、病毒纯化和病毒裂解，纯化后的病毒液加入终浓度的体积比为0.3～0.5％Triton X-100及去氧胆酸钠，混匀后置20～30℃下作用90～120分钟；(4)、加入PB去裂解剂，(5)、除菌过滤后再配制成半成品：用0.01mol/L、pH7.2的PBS将各型原液稀释至血凝素含量为30μg/株/ml，经0.22μm孔径的滤膜过滤，即为半成品。本发明有益的效果是：增加了新型纯化方法，因而可以达到提高收率、提高有效抗原含量、大幅度降低可导致接种反应的成份残余卵清蛋白和裂解剂含量。

主权项

一种制备流感病毒裂解疫苗的新工艺，其特征是：该方法步骤如下：(1)、病毒接种与培养：于鸡胚尿囊腔接种稀释至病毒量2.0‑6.0LgEID50/ml的工作种子批毒种，置33～35℃培养48～72小时；(2)、病毒收获：筛选活鸡胚，置2～8℃一定时间冷胚后，收获尿囊液于容器内，澄清过滤后每个容器取样进行尿囊收获液检定；(3)、病毒灭活：病毒灭活前取样测定蛋白含量，控制蛋白质含量在不超过5mg/ml的范围内进行病毒灭活，收获的含有病毒的尿囊液加入终浓度为200μg/ml的甲醛，置2‑8℃灭活15～24小时；灭活结束分别对每个病毒灭活容器采样，进行病毒灭活验证试验和细菌内毒素含量测定；(4)、病毒收获液浓缩：灭活后的尿囊液经澄清处理，然后用截留分子量为1000KD的超滤膜超滤浓缩不超过10倍；(5)、病毒纯化：5.1蔗糖速率区带离心：在静止时以不超过离心腔容积50％的量泵入体积比为50～60％的蔗糖溶液，同时调节机器转速至35000r/min～40000r/min，连续泵入灭活后的尿囊液，进样完毕，泵入3‑4L缓冲液后，调节转速至0r/min，待机器停稳，在280nm波长监测下，收集病毒峰；5.2柱层析：用Sephrose‑4FF凝胶柱色谱法纯化，上样量不超过凝胶体积的8％，洗脱液为0.01mol/L、pH7.2的PBS，上样及洗脱线性流速为5～6mm/min，检测波长为280nm，收集第一峰，纯化后取样进行蛋白质含量测定；(6)、病毒裂解：纯化后的病毒液加入终浓度的体积比为0.3～0.5％Triton X‑100及去氧胆酸钠，混匀后置20～30℃下作用90～120分钟；(7)、加入PB去裂解剂：向裂解后的病毒液中加入等量1mol/L pH7.2磷酸盐溶液，混合均匀后用离心法或过滤法除去裂解剂，然后将样品用100KD的超滤膜进行超滤洗滤，以进一步去除裂解剂，超滤后的病毒液取样进行细菌内毒素含量测定和微生物限度检查，细菌内毒素含量不高于50EU/ml，微生物限度检查菌数应小于10CFU/ml；(8)、除菌过滤：纯化后的裂解物经0.22μm孔径的滤膜过滤，即为单价原液；(9)、半成品配制：用0.01mol/L、pH7.2的PBS将各型原液稀释至血凝素含量为30μg/株/ml，经0.22μm孔径的滤膜过滤，即为半成品。