[发明专利]土壤微生物固碳酶提取的方法

摘要

本发明公开了一种土壤微生物固碳酶提取的方法，其步骤：A：把土壤依次加入预冷的离子去除剂、磷酸缓冲液，混匀后，于室温离心，收集沉淀；B：取A的沉淀物于细胞样品蛋白提取液中，涡旋混匀，冰浴中用超声波法破碎细胞，离心收集上清液，加入固体硫酸铵至溶解度后，振荡混匀，离心收集析出的蛋白，加溶解液溶解后，保存；C：将B的1，5–二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶蛋白溶液置于水浴中恢复酶活性，紫外分光光度计上测定1，5–二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性以每千克土壤固定CO2的纳摩尔数数的酶活力。方法简便、快速，测定结果重复性好，适合于大批量土壤微生物固碳关键酶1，5–二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶的提取及活性的测定。

主权项

一种土壤微生物固碳酶提取的方法，其步骤是：A、土壤样品的预处理：a、称取新鲜土样于无菌离心管中；b、加5倍体积预冷的土壤各种离子、无机物以及有机物，胞外游离的蛋白去除剂涡旋混匀，于室温10,000×g离心10分钟，收集沉淀，重复该步骤两次；用于去除减少土壤中各种离子、无机物以及有机物，胞外游离的蛋白；所述的离子为：钙离子、铝离子、镁离子、铁离子、镁离子、钾离子；所述的无机物为：硫酸铝、硫酸镁、硫化亚铁、硫酸锰、碳酸钙、碱金属；所述的有机物为：富理酸、胡敏酸、胡敏素、鼠类、鸟类、水稻、小麦、黑麦草、玉米根系、树木细根和粗根系及水稻、小麦、黑麦草、玉米落叶和树木的落枝；所述的土壤离子去除剂为：50毫摩尔/升的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液，20毫摩尔/升的乙二胺四乙酸，100 毫摩尔/升的氯化钠，0.01 克/毫升的聚乙烯吡咯烷酮，pH10.0；c、 加5倍体积预冷的磷酸缓冲液，0.01M，pH 7.4，涡旋混匀，于室温10,000×g离心10分钟，收集沉淀，重复该步骤两次；用于平衡渗透压、维持离子强度和pH7.4；d、加5倍体积的无菌超净水，涡旋混匀，于室温10,000×g离心10分钟，收集沉淀；用于洗涤沉淀并主要去除无机盐离子；e、沉淀通过冷冻干燥后获得无杂质的土样冻干粉，置于‑70℃备用；B、土壤微生物蛋白提取：a、称取2.0克上述预处理后的冷冻干燥样品于10毫升预冷无菌离心管中，加6mL 细胞样品蛋白提取液，涡旋混匀，每个样品3次重复；所述的细胞样品提取液配比为：100毫摩尔/升的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液，1毫摩尔/升的二硫苏糖醇，pH 7.8，100微升2.0微克/毫升的蛋白酶抑制剂；b、置于冰浴中用超声波法彻底破碎细胞；20000×g，4℃下离心15分钟，收集上清液，重复离心操作一次，所有的蛋白液均被收集，加入质量比为80%的固体硫酸铵溶解度后，置于4℃振荡充分混匀，20000×g，4℃下离心20分钟，收集析出的蛋白，加50微升的1，5–二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶溶解液溶解后，获得土壤微生物蛋白后，置于0℃保存待用；所述的1，5–二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶溶解液配比为：100毫摩尔/升pH 7.8的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液和1毫摩尔/升的的二硫苏糖醇；C、土壤1，5–二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶酶活性测定：测定前将土壤微生物蛋白提取溶液置于30℃水浴中20~30分钟以恢复酶活性，测定时环境温度保持30℃，每个样品酶活性测定三次，同时做两个阴性对照，分别为无反应底物1，5‑二磷酸核酮糖对照和热变性细胞蛋白提取物对照，1，5–二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性以二磷酸核酮糖羧化酶的酶活力大小来表示；a、将配制好的反应体系摇匀，倒入比色杯内，以蒸馏水为空白，在紫外分光光度计上340 nm处反应体系的吸光度作为零点值，将50微升1，5–二磷酸核酮糖加于比色杯内，并计时，每隔30秒测一次吸光度，共测3分钟，以计时起到第1分钟内吸光度下降的绝对值计算酶活力；b、不加1，5‑二磷酸核酮糖的对照，对照的反应体系与上述酶反应体系完全相同，不同之处只是把酶提取液放在最后加，加后计时并测定此反应体系在340nm处的吸光度，记录前1分钟内吸光度的变化量，计算酶活力时应减去这一变化量；c、二磷酸核酮糖羧化酶的酶活力的计算：nmol CO2 kg‑1( 土壤)•min‑1＝ΔA×N×C /(6.22×2dΔt)式中：ΔA－反应最初1min内340nm处吸光度变化的绝对值；N－稀释倍数；C－换算系数；6.22－每微摩尔的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在340 nm处的吸光系数；2－每固定1摩尔CO2有2摩尔的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸被氧化；d－比色光程；kg‑1－每千克预处理后土样冻干粉；Δt－测定时间为1分钟。