[发明专利]水稻矮缩病毒三抗夹心酶联免疫吸附检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种水稻矮缩病毒三抗夹心酶联检测试剂盒，试剂盒包含阳性对照、阴性对照、水稻矮缩病毒多克隆抗体、水稻矮缩病毒单克隆抗体、酶标抗体及其它材料和药品，所说的其它材料和药品包括被缓冲液、PBST、病毒抽提缓冲液、封闭缓冲液、底物缓冲液、底物、5块酶标板及20个一次性滴管，水稻矮缩病毒多克隆抗体在分离提纯水稻矮缩病毒后，通过家兔免疫分离血清得到；所述的水稻矮缩病毒单克隆抗体在分离提纯水稻矮缩病毒后，通过小鼠免疫、细胞融合、克隆纯化得到；本发明制备的试剂盒检测灵敏度高、特异性强，可规模化生产用于水稻矮缩病的田间监测。

主权项

一种水稻矮缩病毒TAS‑ELISA检测试剂盒，其特征在于该试剂盒由阳性对照、阴性对照、水稻矮缩病毒多克隆抗体、水稻矮缩病毒单克隆抗体、酶标抗体及其它材料和药品，将阳性对照、阴性对照、水稻矮缩病毒多克隆抗体、水稻矮缩病毒单克隆抗体、酶标抗体及其它材料和药品组装得到，所说的其它材料和药品包括被缓冲液、PBST、病毒抽提缓冲液、封闭缓冲液、底物缓冲液、底物、5块酶标板及20个一次性滴管，所述的水稻矮缩病毒多克隆抗体在分离提纯水稻矮缩病毒后，通过家兔免疫分离血清得到；所述的水稻矮缩病毒单克隆抗体在分离提纯水稻矮缩病毒后，通过小鼠免疫、细胞融合、杂交瘤细胞筛选和克隆纯化得到；所述的水稻矮缩病毒通过采集含有水稻矮缩病毒病株样品、经检侧提纯得到；所述的水稻矮缩病毒采集检测过程为：在田间采集水稻病株样品，经电子显微镜和标准抗体检测含有大量水稻矮缩病毒，且只含有该病毒，样品采集后放入‑80℃冰箱中保存备用；所述的水稻矮缩病毒提纯的过程为：1)取新鲜的感病叶片100g，加300mL的0.1M磷酸盐缓冲液(PB，pH＝6.4)；2)匀浆器充分匀浆，三层尼龙纱布过滤；3)滤液中加入等体积的三氯甲烷，4℃搅拌15min，4℃，2500rpm离心15min；4)取上清，加1/10体积的四氯化碳，4℃搅拌15min，4℃，2500rpm离心15min；5)弃沉淀，上清中加入6％(W/V)PEG(MW6000)，3％NaCl，4℃搅拌溶解，静置2hr，4℃，4500rpm离心20min；6)弃上清，沉淀用少量PB(0.1M，PH＝6.4)悬浮，4℃，4500rpm离心20min。7)重复(6)5‑6次，合并上清；8)上清中加入6％(W/V)PEG(MW6000)，3％NaCl 4℃搅拌溶解，4℃静置4‑8hr；9)4℃，4500rpm离心20min；10)弃上清，沉淀用PB(0.1M，pH＝6.4)悬浮，3mL/100mg；11)用0.01M，pH6.4磷酸缓冲液分别配制20％、30％、40％和50％的蔗糖液(W/W)。以BECKMANSW28转头的离心管按7ml(20％)、7ml(30％)、8ml(40％)和8ml(50％)的比例由低浓度开始加入管中。用10ml注射器和长针头将蔗糖液依次注入离心管底部，最后加3ml 60％(W∶W)的蔗糖垫，形成由上至下，浓度由低到高的梯度柱，放置12‑15小时后使用；12)将所得悬浮液上密度梯度离心，在4℃，15000rpm，2hr条件下，收集乳白色环带，所得溶液即为提纯的病毒制剂；13)该病毒提纯液电镜下观察含较大量的水稻矮缩病毒病毒粒子，未见杂质；紫外分光光度仪上测定A260/A280＝0.869，电镜负染法测相对纯度，‑80℃保存备用；所述的水稻矮缩病毒多克隆抗体由以下过程制备得到：选用2kg以上健康雄兔作为免疫动物，提纯水稻病毒稀释至1mg/mL作为免疫抗原，取1mL病毒液于雄兔耳静脉注射，1周后再重复注射一次，依次重复注射4周后，第5周耳静脉采血，采血后，分离血清，得水稻矮缩病毒多克隆抗体，分装于2mL无菌离心管中，加入0.1％NaN3，‑80℃保存备用；所述的水稻矮缩病毒单克隆抗体由以下过程制备得到：用提纯的水稻矮缩病毒注射免疫BAL B/C小白鼠STU系3月龄雌鼠，取其脾细胞使之与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合；取融合细胞培养上清，用间接ELISA方法筛选抗体阳性孔，选择呈强阳性反应的细胞孔，进行有限稀释法克隆，经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。