[发明专利]一种改进细胞色素P450酶家族体外表达的方法

摘要

本发明涉及细胞色素P450酶，特别涉及一种改进细胞色素P450酶家族体外表达的方法。一种改进细胞色素P450酶家族体外表达的方法，其特征在于在步骤D所述的辅助因子为如下任意一种：①0.5-6μg/mlHemin；②0.05-0.6mM5-ALA；③0.01-0.4mMFe3+；④0.05-0.6mM-ALA和0.01-0.4mMFe3+混合物，首次对CYP蛋白、POR蛋白及其共表达的条件进行了系统优化，结果发现同时给予0.02mMFe3+和0.2mM5-ALA处理细胞，上述蛋白表达水平及其活性最高。CYP的MOI为5pfu/细胞、POR的MOI为2pfu/细胞时，两者的共表达效率最高。

主权项

一种改进细胞色素P450酶家族体外表达的方法，其特征在于在步骤D所述的辅助因子为如下任意一种：①0.5‑6μg/ml Hemin；②0.05‑0.6mM 5‑ALA；③0.01‑0.4mM Fe3+；④0.05‑0.6mM ‑ALA 和0.01‑0.4mM Fe3+混合物；具体制备方法如下：A、重组转移载体pFastBac1‑CYPs/POR质粒的构建与鉴定双酶消化重组质粒pcDNA3.1(+)/POR和转移质粒载体pFastBacTM 1 ，经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，回收目的片段；用T4 DNA连接酶连接回收的POR基因与载体pFastBac 1片段，构建重组转移载体质粒pFastBac1‑POR；经氨苄青霉素抗性平板筛选，获得含重组质粒的大肠杆菌，提取菌液DNA，获得重组转移载体质粒DNA；使用双酶切消化验证pFastBac1‑CYP2A13和pFastBac1‑POR；B、重组真核表达病毒Ac‑Bacmid‑CYPs/POR DNA的构建与鉴定将已构建好的pFastBac1‑CYPs/POR重组质粒转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞，在DH10Bac大肠杆菌的助手质粒Helper辅助下经Tn7转座子转座，将各CYPs/POR的基因片段插入穿梭载体Bacmid中，经卡那霉素、庆大霉素和四环素三抗筛选和蓝白斑筛选，得到重组Ac‑Bacmid‑CYPs/POR DNA，用PCR反应进行验证；C、重组真核表达病毒Ac‑Bacmid‑CYPs/POR的获得在6孔板接种9×105个细胞/孔，27℃贴壁1h；现配杆粒DNA与Cellfectin转染试剂复合物对细胞进行转染，27℃孵育5h后，加入2ml Sf‑900 II SFM培养液含青霉素100 IU/ml；链霉素100 μg/ml，27℃孵育72h或直到看到病毒感染的迹象为止；收取含有目的基因的第一代重组病毒液，再用此病毒液感染Sf9细胞，收取第二代重组病毒液，可以保存备用或感染Sf9细胞以得到更高效价的病毒液；D、重组CYP450s/POR蛋白的表达使用重组病毒液感染Sf9细胞，加入辅助因子，以表达有活性的CYP450蛋白；感染后72小时收集细胞，超声破碎细胞，然后差速离心分离出细胞中的微粒体蛋白，分装后‑80℃保存备用；以空载体病毒感染细胞表达的蛋白做阴性对照，进行SDS‑PAGE电泳，以免疫印迹法检测CYP2A13和POR蛋白的表达，使用扫描仪扫描Immunoblotting条带，用Image J 1.43软件对条带进行灰度值分析；E、CO‑差示光谱法检测CYP450蛋白活性采用CO差示光谱法检测CYP450蛋白酶活性：微粒体悬液用微粒体蛋白稀释缓冲液稀释至1mg/ml，取1ml加入到1cm光径的比色皿中，然后加入适量的保险粉，用封口膜封口混匀后测定blank，缓慢通入CO 2分钟，混匀使CO与微粒体充分接触，然后在紫外分光光度计的wavelength scan模式下扫描400nm至550nm处的吸收光谱，再依据相关公式计算微粒体蛋白中CYP450蛋白的含量；F、细胞色素C分析法检测POR蛋白活力在1cm光径的比色皿中加入0.84ml的还原酶分析缓冲液，然后加入0.1ml 0.8 mM细胞色素C，再加入20µl稀释适当倍数的微粒体悬液，混匀后测定blank，然后加入50µl 4mM的NADPH，用封口膜封口后，迅速混匀，立即用紫外分光光度计的kinetic/time模式检测3分钟内550nm处的吸光值变化，再依据公式计算还原酶活力。