[发明专利]禽流感病毒H5亚型套式荧光RT-PCR检测方法及检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种高效率、敏感性高的禽流感病毒H5亚型套式荧光RT-PCR检测方法及检测试剂盒。该方法利用两套PCR引物（1对外侧引物和1对内侧引物）进行两轮PCR扩增的方法，即将外侧引物进行PCR扩增后的产物作为内侧引物进行PCR扩增的模板，内侧引物与模板DNA的结合位点处于外侧引物扩增出的DNA片段内侧，套式PCR对减少或消除非特异性扩增及提高灵敏度非常有效。本发明相比于普通检测方法具有良好的特异性，可准确地检测H5N1、H5N2亚型AIV，而H1N1、H3N2、H6、H9NDVLasata及EDSV检测为阴性,十分有利于鱼类养殖水体中的禽流感病毒微量模板的扩增，能完全满足鱼塘养殖用水中禽流感病毒检测的敏感性和特异性的要求。

主权项

一种禽流感病毒H5亚型套式荧光RT‑PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：A：提取待检样品RNA；B：设立阳性对照和阴性对照，按照配置好的反应体系，用外引物（P1、P2）进行一步法RT‑PCR，所述外引物（P1、P2）的序列分别为：P1：5’‑AGCAAAAGCAGGGGT C/A T/C A/G ATCT‑3’P2：5’‑AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTAACTACA‑3’；   C：以上述一步法RT‑PCR产物为模板，将内引物（P3、P4）及探针和反应组分置于荧光PCR仪中进行荧光PCR扩增反应，所述内引物（P3、P4）及探针序列分别为：      P3：5’‑CAGTGGCGAGTTCCCTAGCA‑3’       P4：5’‑TCCATTGGAGCACATCCATAAA‑3’       探针：Fam‑5’‑TGGCAATCATGGTGGCTGGTCTAT‑3’‑Tamara；   D：反应结束后，根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和CT值判定结果。