[发明专利]一种结核分枝杆菌复合群的荧光定量RT-PCR检测方法

摘要

本发明属于生物工程检测技术领域，具体为一种结核分枝杆菌复合群的荧光定量RT-PCR检测方法。本发明包括如下步骤：结核分枝杆菌复合群特异性定量RT-PCR引物和探针设计；标准分子的构建；细菌样本RNA与DNA的共同提取；对同一份样本分别进行RT-PCR和PCR；荧光定量PCR检测方法的建立和优化。用本发明的方法检测结核分支杆菌复合群具有快速简单、灵敏度高、特异性强、且能区分死菌与活菌的优点，解决了现有检测方法中检测周期长、阳性率低、不能区分死活菌的不足，具有重要的的实际应用价值。

主权项

一种结核分枝杆菌复合群的荧光定量RT‑PCR检测方法，其特征在于具体步骤如下：(1)结核分枝杆菌复合群特异性定量RT‑PCR引物和探针设计在RDP核糖体序列分析数据库中检索结核分枝杆菌复合群的16srRNA全序列，通过生物信息学比对分析,选取序列保守片段，设计一条逆转录引物和一对PCR引物以及一条Taqman探针，探针5'端的荧光报告基团是FAM，3'端标记的是荧光淬灭基团为TAMRA，引物和探针位于结核分枝杆菌复合群16srRNA区域，目的扩增片段为100 bp，扩增序列为：GGGATGCATGTCTTGTGGTGGAAAGCGCTTTAGCGGTGTGGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGACGGCCTACCAAGGCGACGACGG引物和探针序列为：逆转录引物：CCGTATCTCAGTCCCAGTGT上游引物：MTBC‑F: GGGATGCATGTCTTGTGGTG下游引物：MTBC‑R: CCGTCGTCGCCTTGGTAGTaqman探针序列：5'‑FAM‑CGGGCTCATCCCACACCGCTA‑TAMRA‑3'；(2)定量标准品的构建根据确定的PCR产物，利用DNA重组技术将包含目的扩增片段的基因克隆到质粒载体pGEM‑T Easy 中，构建的重组质粒作为检测结核杆菌复合群的定量标准品；(3)样本中结核分枝杆菌复合群的分离及其核酸的提取，使提取的样本中同时含有DNA与RNA成分；(4)对提取的同一例样本分别进行RT‑PCR和PCR，计算出起始样本中RT‑PCR/PCR的拷贝数比值，从而区分样本中死菌与活菌。