[发明专利]一种沙棘铜/锌SOD的制备与修饰过程同步完成的方法

摘要

本发明涉及一种沙棘铜/锌SOD的制备与修饰过程同步完成的方法，该方法首先将新鲜沙棘枝的粗提液经丙酮分级沉淀后，根据SOD对抑制剂的敏感性不同判断为铜/锌SOD；然后将铜/锌SOD粗制品吸附在DEAE-52层析柱上，不经洗脱分离，直接用活化的mPEG-20000对吸附在柱上的铜/锌SOD进行化学耦合修饰，最后通过特异性洗脱分离获得PEG-铜/锌SOD，从而实现了沙棘中铜/锌SOD分离纯化和修饰过程同步完成。本发明不但解决了目前蛋白质的分离纯化和修饰是两个相互独立的过程而引起的蛋白质变性失活，过程操作步骤多、周期长等长期困扰的问题，而且修饰后的mPEG-铜/锌SOD的活力比未修饰前有所提高，具有安全性高、稳定性更好的特点。

主权项

一种沙棘铜/锌SOD的制备与修饰过程同步完成的方法，包括以下步骤：(1)将洁净的沙棘枝在0～4℃温度下粉碎后，按1∶5～1∶15的料液重量体积比加入磷酸缓冲液，并在该温度下进行超声提取，得到提取液；(2)将所述提取液经离心过滤后，得到上清液；(3)在所述上清液中加入其体积的0.3～0.4倍的丙酮，置冰浴中搅拌后离心过滤，得到超氧化物歧化酶沉淀物；(4)在0～4℃温度下，用料液重量体积比为1∶2～1∶5的磷酸缓冲液对所述超氧化物歧化酶沉淀物进行溶解，经离心分离后得到沙棘超氧化物歧化酶粗制品；(5)选择KCN和H2O2作为抑制剂，并根据不同类型超氧化物歧化酶对不同抑制剂的敏感性不同来判断所述沙棘超氧化物歧化酶粗制品为铜锌超氧化物歧化酶粗制品；(6)将所述铜锌超氧化物歧化酶粗制品上平衡后的DEAE‑52层析柱，并用5BV～7BV的Tris‑HCl缓冲液平衡；其中Tris‑HCl缓冲液的pH值为7.4～8.6，浓度为25mmol/L～60mmol/L；(7)在所述装有铜锌超氧化物歧化酶粗制品的DEAE‑52层析柱上，用溶于的硼酸‑硼砂缓冲液的活化好的分子量为20000的单甲醚聚乙二醇来修饰铜锌超氧化物歧化酶；(8)用pH值为7.4～8.6、浓度为15mmol/L～30mmol/L的Tris‑HCl缓冲液对所述修饰铜锌超氧化物歧化酶的DEAE‑52层析柱进行浓度为0.1mol/L～0.4mol/L的NaCl梯度洗脱，得到洗脱液，该洗脱液经电泳鉴定修饰酶后，收集修饰酶，并测定所述修饰酶的活力即可。