[发明专利]一种鸡传染性鼻炎类脂灭活疫苗的制备方法

摘要

本发明提供了一种鸡传染性鼻炎类脂灭活疫苗的制备方法，属于兽用生物制品制备领域。本发明是这样实现的，制备好A型和C型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液，取上述制备的A型和C型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液按体积比为1∶1的比例混合后倒入乳化罐内，用混合机搅拌，同时再加入杨树皮类脂，加入杨树皮类脂速度不能快，使杨树皮类脂液在混合物中的最终体积百分比浓度为2.0～3.8％，继续搅拌、乳化30～60分钟，即得到疫苗，A型、C型菌株在疫苗中的最终含菌量均为10亿cfu/ml。疫苗容易吸收、无毒副作用、免疫产生时间短、免疫持续期长，免疫效果好，能有效预防鸡传染性鼻炎和鸡毒支原体病。

主权项

一种鸡传染性鼻炎类脂灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液的制备，包括如下步骤：一级菌种制备：取A型副鸡嗜血杆菌菌种划线接种于鸡肉汤琼脂平板上，在CO2体积含量为5％、温度为37℃环境中培养16～18h，挑选符合菌株特性的直径为1mm的3～5个典型菌落用10ml灭菌鸡肉汤稀释后接种到6～7日龄SPF鸡胚卵黄囊内，每胚接种0.2ml，在37℃条件下继续孵化，收集30h内死亡胚的卵黄液，经纯粹检验确认无杂菌后，作为一级菌种，置于‑20℃以下保存，不得超过30天；二级菌种制备：取一级菌种，按体积为半合成培养基体积1/200的量接种于半合成培养基中，在温度为37℃条件下培养17～18h，经纯粹检验确认无杂菌后，即为二级菌种，并置于2‑8℃保存，不得超过6～8h；制苗用菌液的制备：将二级菌种按体积为半合成培养基体积1/40的量接种于半合成培养基中，在37‑38℃温室中静止培养18～20h，期间每隔6～8h摇晃一次，经纯粹检验确认无杂菌污染，加入体积为半合成培养基体积1/2000的甲醛灭活24h，得到制苗用菌液；菌液的浓缩与灭活：将纯粹检验合格的制苗用菌液进行浓缩，浓缩后含菌量不少于50亿cfu/ml，再分别加入体积为浓缩菌液体积1/1000的甲醛和体积为浓缩菌液体积1/10000的硫柳汞，混匀后在4℃条件下灭活2天，经无菌检验合格得到A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液；(2)C型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液的制备，其制备方法与A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液的制备方法相同；(3)疫苗的制备：取上述制备的A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液和C型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液按体积比为1∶1的比例混合后倒入乳化罐内，用混合机以750～850r/min的转速搅拌，同时再加入杨树皮类脂，加入杨树皮类脂速度不能快，使杨树皮类脂液在混合物中的最终体积百分比浓度为2.0～3.8％，然后将混合机的转速提高到2500～3000r/min继续乳化30～60分钟，即得到疫苗，A型、C型菌株在疫苗中的最终含菌量均为10亿cfu/ml；所述鸡肉汤琼脂板是这样制备的：取鸡肉汁100ml、酪蛋白胨1g、氯化钠0.5g、琼脂粉1.5g混合，用4mol/L NaOH溶液调节混合溶液的PH至7.4，116℃灭菌30分钟，倒板前加入辅酶I(NADH)和过滤除菌的健康鸡血清混匀，使得混合溶液中辅酶I(NADH)的质量浓度为0.05％、过滤除菌的健康鸡血清的体积百分比浓度为10％，然后将混合溶液倒入直径为90mm的平皿中，放平冷却即得到鸡肉汤琼脂板；所述鸡肉汁是取鸡胸脯肉泥1重量份加入蒸馏水4重量份，4℃浸泡过夜，煮沸30分钟，除去肉渣，澄清过滤得到的；所述半合成培养基是这样制备的：取多蛋白胨5g、酪蛋白胨30g、谷氨酸钠15g、酵母浸粉5g、葡萄糖3g、氯化钠15g，放入1000ml纯化水中搅均，调节所得溶液的PH至7.2～7.4，116℃灭菌40分钟，临用前加入60ml的灭活健康鸡血清和10ml的浓度为0.5％的辅酶I(NADH)水溶液。