[发明专利]用于检测J亚群禽白血病病毒的斑点杂交方法

摘要

本发明涉及一种用于检测J亚群禽白血病病毒的斑点杂交方法。所述的核酸探针是基于J亚群禽白血病病毒囊膜env特异性基因序列，长度为248bp，位置在hprs-103原型毒株的第6736bp-6983bp之间，通过合成该目的基因，大量克隆；标记制备ALV-J的核酸探针；提取接毒细胞DNA，用斑点杂交的方法进行检测，在尼龙膜固定DNA，预杂交和杂交，洗膜，显色检测斑点杂交反应阳性。通过摸索ALV-J核酸探针与DNA反应最佳反应温度为50℃，探针反应浓度25ng/ml，确定用于检测ALV-J的斑点杂交方法，斑点杂交的结果表明该核酸探针能有效地检测出ALV-J，对禽白血病各亚群、马立克氏病、网状内皮增生症有效地进行鉴别诊断，并且该核酸探针的检测快捷准确，因此本发明为J亚群禽白血病的诊断提供了新的思路和方法。

主权项

一种用于检测J亚群禽白血病病毒的斑点杂交方法，其特征在于：通过此较国内外各J亚群禽白血病病毒代表毒株env基因同源性，从gp37基因设计出高度保守长度约248bp目的基因片段，用以作为制备核酸探针的基序，位置在Hprs‑103原型毒株基因序列第6736‑6983bp之间，合成该目的基因，进行大量克隆；制备标记核酸探针，其探针的标记浓度在50‑80ng/μl；运用斑点杂交的技术，取适当大小带正电尼龙膜，提取接毒细胞DNA，在尼龙膜上点样固定DNA，进行预杂交和杂交反应，反应温度范围在42‑54℃，反应探针浓度在20‑30ng/ml，依次在洗液I和洗液II中浸泡、冲洗液冲洗、封闭液和抗体稀释液中浸泡、冲洗液冲洗、检测缓冲液中平衡PH值，避光，显色观察。