[发明专利]在大肠杆菌中无需包涵体复性制备溶栓药物瑞替普酶的方法

摘要

本发明涉及一种无需包涵体复性、直接通过大肠杆菌表达系统制备溶栓药物瑞替普酶(Reteplase，rPA)的方法。通过PCR扩增得到rPA的基因片断，将该基因片断克隆到载体pET40b中，构建得到pET40b-rPA重组质粒，且使rPA与载体pET40b中的二硫键异构酶DsbC融合表达。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，分别优化确立了IPTG及乳糖的诱导表达条件。所获得目的融合蛋白主要以可溶性成分表达，经镍柱亲和层析纯化后，用Xa因子(或甲酸、凝血酶)处理可获得高纯度的rPA目的蛋白。纤维蛋白平板法检测结果显示：本方法所获得的融合蛋白DsbC-rPA及去除标签纯化所得rPA蛋白均具有显著的溶栓活性。

主权项

一种无需包涵体复性、直接在大肠杆菌中高效表达瑞替普酶的方法，其特征在于包括如下的步骤：(1)将rPA编码基因插入到表达载体pET40b的多克隆位点，使其位于DsbC信号肽及其编码基因下游，构建得到pET40b‑rPA重组质粒；(2)将pET40b‑rPA转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌；(3)培养该重组大肠杆菌，诱导表达；(4)收集菌液，超声离心后，分别对上清及沉淀进行SDS‑PAGE检测；(5)分离纯化得到目的融合蛋白DsbC‑rPA，或经镍柱亲和层析纯化，用Xa因子(或甲酸、凝血酶)处理，去除DsbC标签，得到高纯度、高活性的rPA目的蛋白。