[发明专利]海绵共附生抑菌活性菌株筛选方法

摘要

本发明涉及一种海绵共附生抑菌活性菌株筛选方法，将海洋细菌pks基因分子生物学筛选与抑菌活性检测相结合，首先，分离纯化海绵共附生菌株，通过酚-氯仿方法提取海绵共附生菌DNA并以此为模板，以细菌pks基因的ks域通用引物GB1/GB2为引物，进行聚合酶链反应扩增pks基因片段，获得海绵共附生菌的690bp片段经测序后，提交Genbank，并Blast分析；测定pks阳性菌株的抑菌活性；以筛选到有690bp目标片段的抑菌活性菌株DNA为模板，以细菌16S rDNA通用引物27f/1492r为引物，聚合酶链反应扩增目的片段以及测序鉴定，所获得的序列提交GenBank，并Blast分析，确定pks基因片段阳性海绵共附生抑菌活性菌株的种属。

主权项

一种海绵共附生抑菌活性菌株筛选方法，其特征在于包括如下步骤：1)取4℃保存和甲醇浸泡的海绵，用无菌手术刀切成小于1mm3的碎块；然后，将海绵碎块在无菌条件下直接散置于平板上，28℃培养4-5天以保证海绵内吸附的微生物释放；当平板上有菌落形成后，挑取菌落在分离培养基上划线分离单菌落；或者，取海绵碎块加无菌生理盐水研磨，加10倍于海绵碎块体积的生理盐水，按梯度10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9依次稀释后，分别涂布于平板上，28℃培养2-3天；当平板上有菌落形成后，挑选单菌落数为30-300个的平板，从中挑取单菌落，在分离培养基上划线分离单菌落；所述分离培养基为牛肉膏蛋白胨人工海水培养基，其组分为10g蛋白胨，5g牛肉膏，5gNaCl，1000ml人工海水，pH 7.2-7.4；2)将所获单菌落重复划线2到3次，获得形态单一的海绵共附生菌，并将得到的各菌株编号；3)通过酚-氯仿方法提取海绵共附生菌DNA；4)以海绵共附生菌DNA为模板，以细菌的pks基因片段的ks域通用引物GB1/GB2为引物，GB1：5‘-RTRGAYCCNCAGCAICG-3’；GB2：5‘-VGTNCCNGTGCCRTG-3’，扩增pks基因片段，获得690bp的片段；将割胶纯化的690bp片段与pUCm-T载体连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞；将转化的大肠杆菌感受态细胞用pUCm-T载体引物T7/M13进行聚合酶链反应扩增，对扩增结果阳性的菌落进行测序，对测得的序列进行Blast分析，获得pks基因片段阳性海绵共附生菌；5)以琼脂扩散法对pks基因片段阳性海绵共附生菌进行抑菌活性测定，指标菌为金黄色葡萄球菌、黑曲霉、白假丝酵母、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌；每株待测菌对每株指标菌的抑菌实验至少3次重复；6)以筛选所得的pks基因片段阳性海绵共附生抑菌活性菌的DNA为模板，以细菌16S rDNA通用引物27f/1492r为引物，聚合酶链反应扩增16S rDNA的1600bp目的片段，纯化的目的片段与pUCm-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，用pUCm-T载体引物T7/M13进行聚合酶链反应扩增筛选白色重组克隆，对扩增结果阳性的菌落提取质粒进行16S rDNA测序，测序后序列提交到GenBank，并进行Blast分析，确定所得的pks基因片段阳性海绵共附生抑菌活性菌的种属。