[发明专利]同时测定蜂王浆中林可霉素和大环内酯类残留量的方法

摘要

本发明涉及一种采用液相色谱串联质谱而同时测定蜂王浆中林可霉素和大环内酯类残留量的方法，目前该方法还达不到检测成本低，检测限小于1μg/kg的目的。本发明包括标准溶液制备、蜂王浆样品处理、标准曲线制作和蜂王浆样品检测工序；蜂王浆样品处理工序中使用体积浓度为97％的乙腈氨水做为提取液，将50ml玻璃离心瓶中经减压浓缩后的残渣用磷酸盐缓冲溶液来转移，再向乙酸乙酯混合进行提取；最后将上机检测样液通过高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪测得蜂王浆中林可霉素和大环内酯类的残留量。本发明检测成本低，检测效率高，检测限达到0.2-0.9μg/kg，线性相关系数在0.9914-0.9994。

主权项

一种同时测定蜂王浆中林可霉素和大环内酯类残留量的方法，其特征在于：该方法所用到的原料包括纯度＞99.5％的林可霉素盐酸盐，纯度＞92.2％的红霉素，纯度＞95.0％的泰乐菌素酒石酸盐，纯度＞96.5％的竹桃霉素磷酸盐，纯度＞98.5％的替米考星，纯度＞72.0％的吉他霉素，纯度＞96.0％的螺旋霉素，纯度＞97.5％的罗红霉素，纯度＞98.0％的交沙霉素，为农残级的乙酸乙酯，为分析纯的氨水、磷酸二氢钠、氢氧化钠和无水Na2SO4，为优级纯的正己烷，为液相色谱纯的乙腈和乙酸铵，磷酸盐缓冲溶液，初始流动相，水；所述磷酸盐缓冲溶液通过13.8g磷酸二氢钠溶解于950mL水中，再用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值到8.0，最后用水稀释至1L制备而成；所述初始流动相中的有机相为乙腈，水相中含有体积浓度为0.1％的甲酸和浓度为0.5mmol/L的乙酸铵，所述有机相与水相的体积比为5∶95；该方法所用到的设备包括三重四极杆串联质谱仪，配有二元泵、在线脱气机、自动进样器、数据处理软件的高效液相色谱仪，旋转蒸发器；所述三重四极杆串联质谱仪中的离子源温度为600℃，辅助加热气GS1为70psi，干燥气GS2为70psi，气帘气CUR为20psi，碰撞气CAD为2psi，电喷雾电压IS为4700V，离子化法为正离子模式；所述高效液相色谱仪为Agilent 1200series，色谱柱为Inertsil C8-3，色谱柱的规格为2.1×150mm，3μm，进样量为20μl；该方法包括标准溶液制备工序、蜂王浆样品处理工序、标准曲线制作工序和蜂王浆样品检测工序；所述标准溶液制备工序如下：a、混合贮备标准溶液配制步骤：各称取净含量为10mg的林可霉素盐酸盐、红霉素、泰乐菌素酒石酸盐、竹桃霉素磷酸盐、替米考星、吉他霉素、螺旋霉素和交沙霉素，分别采用乙腈定容至10ml而配制成浓度均为1000mg/L的林可霉素盐酸盐标准混合贮备液、红霉素标准混合贮备液、泰乐菌素酒石酸盐标准混合贮备液、竹桃霉素磷酸盐标准混合贮备液、替米考星标准混合贮备液、吉他霉素标准混合贮备液、螺旋霉素标准混合贮备液和交沙霉素标准混合贮备液，将上述林可霉素盐酸盐标准混合贮备液、红霉素标准混合贮备液、泰乐菌素酒石酸盐标准混合贮备液、竹桃霉素磷酸盐标准混合贮备液、替米考星标准混合贮备液、吉他霉素标准混合贮备液、螺旋霉素标准混合贮备液和交沙霉素标准混合贮备液置于-18℃以下保存待用；b、混合中间标准液配制步骤：分别取a中的林可霉素盐酸盐标准混合贮备液、红霉素标准混合贮备液、泰乐菌素酒石酸盐标准混合贮备液、竹桃霉素磷酸盐标准混合贮备液、替米考星标准混合贮备液、吉他霉素标准混合贮备液、螺旋霉素标准混合贮备液和交沙霉素标准混合贮备液各100μl，分别采用乙腈定容至10ml而配制成浓度均为10mg/L的林可霉素盐酸盐混合中间标准液、红霉素混合中间标准液、泰乐菌素酒石酸盐混合中间标准液、竹桃霉素磷酸盐混合中间标准液、替米考星混合中间标准液、吉他霉素混合中间标准液、螺旋霉素混合中间标准液和交沙霉素混合中间标准液；c、罗红霉素内标配制步骤：称取净含量为10mg的罗红霉素并用乙腈定容至10ml而配制成浓度为1000mg/L的罗红霉素标准混合贮备液，取罗红霉素标准混合贮备液100μl用乙腈定容至10ml而配制成浓度为10mg/L的罗红霉素内标中间溶液；d、临时标准使用液配制步骤：取林可霉素盐酸盐混合中间标准液、红霉素混合中间标准液、泰乐菌素酒石酸盐混合中间标准液、竹桃霉素磷酸盐混合中间标准液、替米考星混合中间标准液、吉他霉素混合中间标准液、螺旋霉素混合中间标准液和交沙霉素混合中间标准液分别用乙腈配制成浓度为100μg/kg的一号林可霉素盐酸盐临时标准使用液、一号红霉素临时标准使用液、一号泰乐菌素酒石酸盐临时标准使用液、一号竹桃霉素磷酸盐临时标准使用液、一号替米考星临时标准使用液、一号吉他霉素临时标准使用液、一号螺旋霉素临时标准使用液和一号交沙霉素临时标准使用液，再取林可霉素盐酸盐混合中间标准液、红霉素混合中间标准液、泰乐菌素酒石酸盐混合中间标准液、竹桃霉素磷酸盐混合中间标准液、替米考星混合中间标准液、吉他霉素混合中间标准液、螺旋霉素混合中间标准液和交沙霉素混合中间标准液分别用乙腈配制成浓度为1000μg/kg的二号林可霉素盐酸盐临时标准使用液、二号红霉素临时标准使用液、二号泰乐菌素酒石酸盐临时标准使用液、二号竹桃霉素磷酸盐临时标准使用液、二号替米考星临时标准使用液、二号吉他霉素临时标准使用液、二号螺旋霉素临时标准使用液和二号交沙霉素临时标准使用液，再取罗红霉素内标中间溶液用乙腈配制成浓度为200μg/kg的罗红霉素内标临时标准使用液；所述蜂王浆样品处理工序中，a、先称取蜂王浆样品5g加入10ml水制得蜂王浆样品液；b、然后将蜂王浆样品液置于100ml离心塑料瓶中，再向100ml离心塑料瓶中加入浓度为200μg/kg的罗红霉素内标临时标准使用液100μl并旋涡混合3min，然后静置15min后再向100ml离心塑料瓶中加入40ml体积浓度为97％的乙腈氨水提取液并混合均匀，然后对置于100ml离心塑料瓶中的液体进行超声提取10min，再在转速为3000rpm下离心5min得到一号上清液；吸取25ml一号上清液置于50ml一号离心瓶中，再向50ml一号离心瓶中缓缓加入10g无水Na2SO4后立即用力振荡脱水，然后在转速为3000rpm下离心2min得到二号上清液，将二号上清液置于50ml玻璃离心瓶中，再将5ml体积浓度为97％的乙腈氨水提取液置于50ml一号离心瓶中，然后向50ml一号离心瓶中缓缓加入10g无水Na2SO4后立即用力振荡脱水，然后在转速为3000rpm下离心2min得到三号上清液，将三号上清液置于50ml玻璃离心瓶中；将50ml玻璃离心瓶中的液体置于旋转蒸发器上于35℃以下减压浓缩至干得到残渣，然后用5ml磷酸盐缓冲溶液将残渣移到15ml塑料离心管中，再向15ml塑料离心管中加入5ml乙酸乙酯并充分混合，然后提取1min，再对15ml塑料离心管中的液体在转速为3000rpm下离心5min后分层，然后取乙酸乙酯层置于10ml离心管中并用氮气吹干，再向10ml离心管中加入初始流动相1ml并进行超声溶解，然后加入2ml正己烷并用力手动振摇充分混合去脂，再在转速为800rpm下离心2min而得到下层样液，将下层样液过0.22μm滤膜而制得上机检测样液；所述标准曲线制作工序中，先称取5份重量均为5.0g的阴性蜂王浆样品分别置于一号试剂瓶、二号试剂瓶、三号试剂瓶、四号试剂瓶和五号试剂瓶中，然后向一号试剂瓶中加入一号林可霉素盐酸盐临时标准使用液、一号红霉素临时标准使用液、一号泰乐菌素酒石酸盐临时标准使用液、一号竹桃霉素磷酸盐临时标准使用液、一号替米考星临时标准使用液、一号吉他霉素临时标准使用液、一号螺旋霉素临时标准使用液和一号交沙霉素临时标准使用液各250μl制得一号阴性蜂王浆液；向二号试剂瓶中加入一号林可霉素盐酸盐临时标准使用液、一号红霉素临时标准使用液、一号泰乐菌素酒石酸盐临时标准使用液、一号竹桃霉素磷酸盐临时标准使用液、一号替米考星临时标准使用液、一号吉他霉素临时标准使用液、一号螺旋霉素临时标准使用液和一号交沙霉素临时标准使用液各500μl制得二号阴性蜂王浆液；向三号试剂瓶中加入二号林可霉素盐酸盐临时标准使用液、二号红霉素临时标准使用液、二号泰乐菌素酒石酸盐临时标准使用液、二号竹桃霉素磷酸盐临时标准使用液、二号替米考星临时标准使用液、二号吉他霉素临时标准使用液、二号螺旋霉素临时标准使用液和二号交沙霉素临时标准使用液各250μl制得三号阴性蜂王浆液；向四号试剂瓶中加入二号林可霉素盐酸盐临时标准使用液、二号红霉素临时标准使用液、二号泰乐菌素酒石酸盐临时标准使用液、二号竹桃霉素磷酸盐临时标准使用液、二号替米考星临时标准使用液、二号吉他霉素临时标准使用液、二号螺旋霉素临时标准使用液和二号交沙霉素临时标准使用液各400μl制得四号阴性蜂王浆液；向五号试剂瓶中加入二号林可霉素盐酸盐临时标准使用液、二号红霉素临时标准使用液、二号泰乐菌素酒石酸盐临时标准使用液、二号竹桃霉素磷酸盐临时标准使用液、二号替米考星临时标准使用液、二号吉他霉素临时标准使用液、二号螺旋霉素临时标准使用液和二号交沙霉素临时标准使用液各500μl制得五号阴性蜂王浆液；然后分别用一号阴性蜂王浆液、二号阴性蜂王浆液、三号阴性蜂王浆液、四号阴性蜂王浆液和五号阴性蜂王浆液来代替蜂王浆样品处理工序中的蜂王浆样品液，并重复蜂王浆样品处理工序中的b步骤而分别制得一号标准液、二号标准液、三号标准液、四号标准液和五号标准液，该一号标准液、二号标准液、三号标准液、四号标准液和五号标准液的系列浓度为5μg/kg、10μg/kg、50μg/kg、80μg/kg和100μg/kg；将一号标准液、二号标准液、三号标准液、四号标准液和五号标准液通过高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪得到标准曲线；所述蜂王浆样品检测工序中，将蜂王浆样品处理工序中制得的上机检测样液通过高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪，并结合标准曲线而测得蜂王浆中林可霉素和大环内酯类的残留量；该方法的检测限达0.2-0.9μg/kg。