[发明专利]供体角膜多种病毒的荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法

摘要

一种供体角膜多种病毒的荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。试剂盒由RNA提取试剂、RNA反转录和扩增试剂和阳性工作标准品组成。其中RNA反转录和扩增试剂包括2X反转录PCR预混试剂，聚合酶，反转录酶，正、反向HCV引物、HIV1引物和RV引物，以及HCV、HIV1与RV荧光探针，HCV、HIV1与RV阴性和阳性对照；阳性工作标准品分别为含有HCV正、反向引物扩增的目的序列的pUC57-HCV质粒，以及HIV1正、反向引物扩增的目的序列的pUC57-HIV1质粒和RV正、反向引物扩增的目的序列的pUC57-RV质粒。本发明实现了对临床供体结膜组织标本的完全闭管检测，不需PCR后处理，避免了交叉污染；同时采用实时检测，所得Ct值和原始模板数量完全呈线性相关，定量准确率极高，相对误差约为50％，足以适应临床核酸定量的要求。

主权项

一种供体角膜多种病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于试剂盒由RNA提取试剂、RNA反转录和扩增试剂和阳性工作标准品组成；其中RNA提取试剂为NucleoSpin RNA II试剂盒；RNA反转录和扩增试剂包括2X反转录PCR预混试剂，Taq DNA聚合酶，反转录酶，正向及反向HCV引物，HCV荧光探针，正向及反向HIV1引物，HIV1荧光探针，正向及反向RV引物，RV荧光探针，无核酸酶的蒸馏水，HCV阴性对照，HCV阳性对照，HIV1阴性对照，HIV1阳性对照，RV阴性对照，RV阳性对照；阳性工作标准品分别为含有HCV正向和反向引物扩增的目的序列的pUC57-HCV质粒，含有HIV1正向和反向引物扩增的目的序列的pUC57-HIV1质粒，含有RV正向和反向引物扩增的目的序列的pUC57-RV质粒；上述的HCV、HIV1或RV的引物、荧光探针与阳性工作标准品序列如下：HCV：正向HCV引物：CTCCCGGGAGAGCCATAGT反向HCV引物：CAAGCACCCTATCAGGCAGTAHCV荧光探针序列：FAM+CGGAACCGGTGAGTACACCGGA+TAMRAHCV扩增片段长度为182bp；HCV阳性工作标准品的目的序列为：ttagtatgagtgtcgtgcagcctccaggaccccccctcccgggagagccatagtggtctgcggaaccggtgagtacaccggaattgccaggacgaccgggtcctttcttggataaacccgctcaatgcctggagatttgggcgtgcccccgcaagactgctagccgagtagtgttgggtcgcgaaaggccttgtggtactgcctgatagggtgcttgcgagtgccccgggaggtctcgtaHCV阳性工作标准品的目的基因的片段长度为240bp；HIV1：正向HIV1引物：CCGGCCATAAGGCAAGAGT反向HIV1引物：TCTCTGCATCATTATGGTAGCTGAAHIV1荧光探针序列：FAM+TGGCTGAAGCAATGAGCCAAGTAAC+TAMRAHIV1扩增片段长度为74bp；HIV1阳性工作标准品的目的序列为：attgtaagactattttaaaagcattgggaccagcggctacactagaagaaatgatgacagcatgtcagggagtaggaggacccggccataaggcaagagttttggctgaagcaatgagccaagtaacaaattcagctaccataatgatgcagagaggcaattttaggaaccaaagaaagattgttaagtgtttcaattgtggcaaagaagggcacacagccagaaattgcagggcccctaHIV1阳性工作标准品的目的基因的片段长度为240bp；RV：正向RV引物：CAGATCCCTAAATGCAACGGTTA反向RV引物：CCCAGATAGCCCCCTAGAACARV荧光探针序列：FAM+TGCTGCATGTGCTCCTCATGA+TAMRARV扩增片段长度为72bp；RV阳性工作标准品的目的序列为：atctccttattcatcaaatgctgttggtcacgtgttcaatctcattcactttgtaggatgctatatgggtcaagtcagatccctaaatgcaacggttattgctgcatgtgctcctcatgaaatgtctgttctagggggctatctgggagaggaattcttcgggaaagggacatttgaaagaagattcttcagagatgagaaagaacttcaagaatacgaggcggctgaactgacaaagacRV阳性工作标准品的目的基因的片段长度为240bp。