[发明专利]一种检测鸭圆环病毒抗体的间接ELISA方法

摘要

本发明涉及一种用于检测鸭圆环病毒抗体的间接ELISA方法，即：利用pET-32a(+)原核表达载体，构建了能表达鸭圆环病毒部分衣壳蛋白(Cap)的基因工程菌BLpET-32a-Cap，并将表达的重组蛋白纯化复性后包被ELISA板，以检测鸭血清中DuCV的抗体水平。结果表明该方法具有重复性好、特异性高的特点，可用于DuCV血清学调查。

主权项

一种检测鸭圆环病毒抗体的间接ELISA方法，其特征在于通过以下步骤实现：A、利用基因工程重组技术构建鸭圆环病毒衣壳蛋白的原核表达质粒，命名为pET-32a-Cap；B、将质粒pET-32a-Cap转入宿主菌大肠杆菌中成为基因工程菌(命名为BLpET-32a-Cap)，将BLpET-32a-Cap在LB培养基中培养，诱导表达并经SDS-PAGE电泳分析显示重组蛋白以不溶性包涵体形式存在于菌体中，表达量占到菌体总蛋白的39％；C、将重组蛋白通过亲和层析进行纯化后复性，Western blot分析表明复性后的重组蛋白具有良好的免疫学活性；D、以重组蛋白为包被抗原制备ELISA检测板，检测鸭血清中DuCV的抗体水平：(1)包被：将纯化复性后的重组蛋白用抗原包被液(0.05mol/L，pH9.6的碳酸盐缓冲液)稀释为4μg/ml的终浓度，每个ELISA孔加入100μl，4℃条件下包被24h，PBST缓冲液(含0.01％Tween-20的PBS缓冲液)洗涤5min×3次；(2)封闭：每孔加封闭液(含1％明胶、1％牛血清白蛋白、5％脱脂奶粉的PBST缓冲液)100μl，37℃作用3h，PBST缓冲液洗涤5min×3次；(3)加待检血清：每孔加入100μl用稀释液按1∶50倍稀释后的血清，37℃作用1.5h，PBST缓冲液洗涤5min×3次；(4)加二抗：每孔加100μl稀释的HRP标记的羊抗鸭二抗(用pH7.0的PBS按1∶1000比例稀释HRP-goat anti-duck IgG)，37℃作用1h，PBST缓冲液洗涤5min×3次；(5)加显色液：每孔加含1mg/ml TMB(四甲基联苯二胺)的显色液100μl，37℃作用避光作用20min；(6)加终止液：每孔加入100μl终止液(2M H2SO4)，酶标仪测定450nm吸光值(OD450)；(7)结果判定：待检血清OD450值≥0.3时判定为鸭圆环病毒抗体阳性，待检血清OD450值＜0.25时判定为鸭圆环病毒抗体阴性，0.25≤OD450值＜0.3时判定为可疑样品，需重新检测，若仍然为0.25≤OD450值＜0.3则判定为鸭圆环病毒抗体阴性。