[发明专利]抗晚疫病和抗甲虫马铃薯新品种培育方法

摘要

一种抗晚疫病和甲虫马铃薯新品系的培育方法，涉及一种利用生物细胞培养技术进行马铃薯新品种的培育方法。利用从马铃薯野生种分离出来的带有抗晚疫病、抗甲虫、抗氧化基因的原生质体(A)，与适应性广泛的马铃薯栽培品种的原生质体(B)，经过电融合，形成带有A和B两种原生质体的融合细胞。经过细胞培养产生愈伤组织，再经过诱导产生出再生体细胞杂种试管苗。这种组培试管苗经过进一步育苗，移栽到温室及大田后，生产出试管1代体细胞杂交薯，进而获得抗病虫细胞杂种种薯；该体细胞杂交薯同时具有马铃薯栽培品种的优良农艺性状和抗晚疫病、抗甲虫性状。为提高马铃薯本身的品质和利用野生种来改良马铃薯栽培品种的抗氧化活性提供了新的可利用的基因资源。

主权项

一种抗晚疫病和甲虫马铃薯新品系的培育方法，其特征在于建立一个新的高效分离马铃薯叶片叶肉细胞原生质体的技术体系，根据不同品种叶片细胞壁对酶处理反应的差异，进行处理条件的调整，分别提出酶浸解、电融合的适宜处理方法，以及愈伤组织诱导和植株再生的培养基和培养条件，解决不同品种材料在原生质体分离数量及质量上存在的差异，进而获得抗病虫细胞杂种种薯；其培育方法如下：(1)酶浸解：以24-40天苗龄的马铃薯野生种S.pinnatisectum和栽培品种的组织培养无病毒试管苗的叶片为材料，酶解前用刀片将叶片切成细片，置于前处理液中处理1-2小时，然后将叶片放入酶解液中，在20℃-30℃全黑暗条件下处理16-30小时，原生质体的纯化采用漂浮和沉降相结合的方法；(2)电融和：将上述马铃薯叶肉细胞经酶处理后所形成的不带细胞壁的裸露细胞即浸解后分离出的马铃薯野生种S.pinnatisectum和栽培品种的原生质体进行电融合，融合仪和电极采用BTX公司的ECM2001型多功能细胞融合仪(BTX，SanDiego，CA，USA)和该仪器配备的3.2毫米电泳槽(Microslide453，BTX，Division of Genetronics Inc.，SanDiego，CA，USA)，融合方法为将浓度为1-3×105个/mL的两亲本马铃薯的原生质体A和B按1∶1的比例混合，悬浮于电融合液中，进行两次连续60μs的直流方波脉冲电流进行处理，使来自野生种S.pinnatisectum原生质体与来自栽培品种的原生质体相互融合，形成融合细胞；(3)诱导培养：将融合细胞放到愈伤组织诱导培养基中培养，形成的愈伤组织团块，进而产生再生植株。培养条件为25℃，黑暗处理，6-8周即可形成愈伤组织团块；(4)植株再生与移栽：将大约2-5mm大小的愈伤组织团块转移到再生培养基上，诱导植株再生，培养条件为20-24℃，弱光强20μE·m-2·s-1，光周期为16小时光照、8小时黑暗，处理30-60天；嫩芽再生后，移到光强120μE·m-2·s-1，20-22℃条件下培养4-6周后，切下嫩芽转移到不含激素的MS基础培养基上继代培养1-2个月，完整的再生植株移栽到温室的花盆中，产生体细胞杂种种薯；(5)抗病虫鉴定：采用叶片离体分离的方法对体细胞杂种薯块进行抗病抗虫鉴定，证实他们具有与抗性亲本相同的抗晚疫病和抗甲虫的能力。