[发明专利]一种花生过敏原标准物的制备方法与应用

摘要

一种花生过敏原标准物的制备方法与应用，属于生物技术领域。本发明通过采取活性蛋白冷阱萃取、低温离心和分子印迹等多种技术相结合的手段，将高致敏性蛋白组分从花生原料中分离出来，最大程度保留蛋白的生物活性，并通过免疫柱层析、饱和硫酸铵沉淀和AKTA蛋白纯化系统进行分离纯化，制备花生过敏原标准物，获得标准物的纯度达到98％以上；以此过敏原标准物制备的血清纯化后效价达到1∶100000，构建的酶联免疫检测方法ELISA最低检出限达0.1ng/mL。

主权项

一种花生过敏原标准物的制备方法，其特征在于，制备方法包括如下步骤：(1)脱脂花生种子脱皮后在液氮中破碎成粉，正己烷脱脂，按照花生粉末质量∶正己烷体积为1∶10(W/V)进行室温振荡萃取1h(小时)，4℃5000r/m离心10min，弃上清，氮吹10min，得到脱脂花生蛋白粉，4℃保存；(2)浸提液按照重量体积比1∶10(W/V)，将花生蛋白脱脂粉溶解在4℃预冷2h的1.0mol/L，pH7.0的磷酸缓冲液(含0.2mol/L的氯化钠)中，同时加入等体积的0.01mol/Lβ-巯基乙醇和0.5g/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA·2Na)溶液混合浸提，4℃下静置过夜。然后浸提液在4℃16000r/m离心10min后取上清，沉淀用各自的浸提液继续抽提4h，离心后合并上清液，即为花生蛋白浸提液；(3)饱和硫酸铵溶液分级沉淀饱和度30％的硫酸铵溶液的制备，称取硫酸铵(AR)35g，以50-80℃的超纯水100mL溶解，搅拌20min，趁热过滤，4℃冷却4h。缓慢加入花生浸液，4℃下静置12h，16000r/m离心30min，上清液继续缓慢加入硫酸铵30g至饱和度达65％，4℃，16000r/m离心30min，沉淀用PBS复溶，4℃保存；(4)等电点沉淀在pH计的监控下等电点沉淀，加2mol/L的H2SO4至花生过敏原Arah2 pI5.2，25000r/m离心30min，上清液进一步沉淀，调pH至花生过敏原Arah1 pI4.55。所得沉淀物均复溶于PBS中，即为花生过敏原蛋白提取液；(5)纯化和制备将花生蛋白提取液分装入透析袋，用重蒸水透析24h(4℃)，使用AKTA系统进行纯化和制备，条件：经Superdex200(10×300mm)凝胶柱层析，以pH7.0的含0.15mol/L NaCl的50mmol/L磷酸缓冲液进行洗脱，蠕动泵流速25mL/h，10min间隔自动收集，监测280nm吸收，收集所需峰值样品，合并后用重蒸水透析24h(4℃)。样品冰冻干燥后即为花生过敏原蛋白纯品。