[发明专利]人BAFF-R基因启动子活性的测定方法

摘要

本发明公开了一种人BAFF-R基因启动子活性的测定方法，包括引物设计、BAFF-R基因5’侧翼区的克隆、BAFF-R基因5’侧翼区序列缺失质粒的构建、细胞培养、重组报告基因质粒瞬时转染细胞、荧光素酶活性检测等步骤。本发明易操作、准确，测定了BAFF-R基因5’上游序列在不同细胞中转录活性的差异及其不同区域转录活性的差异，确定了BAFF-R基因的核心启动子所在区域，对于研究BAFF-R基因转录调控元件的作用，及阐明该基因的表达调控机制奠定了基础。

主权项

1.一种人BAFF-R基因启动子活性的测定方法，其特征是：包括下列步骤：(1)引物设计：用引物设计软件按叠瓦方式在BAFF-R基因5’侧翼序列设计八个片段的引物，八对引物具有相同的下游引物，引物的3’端加限制性内切酶HindIII位点，5’端加限制性内切酶Mlu I位点，同时在两端分别添加6个保护碱基，便于酶切插入到载体的多克隆位点；八个片段的引物序列及下游引物序列为：其中1-8为八个不同长度片段的上游引物序列，9为八个片段3’端共同的下游引物序列；上述引物作为扩增相应产物B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8的引物，B1～B8分别与上述引物1～8对应；(2)BAFF-R基因5’侧翼区的克隆：从人全血中提取基因组DNA作为模板，应用LATaq酶PCR扩增目的片度B8；用限制性内切酶Mlu I、Hind III酶切胶回收纯化后的PCR扩增产物B8及pGL3-Basic载体，酶切产物经T₄连接酶连接，连接混合产物转化大肠埃希菌DH5α，酶切测序鉴定阳性克隆，得到阳性重组质粒，命名为pGL3-B8；(3)BAFF-R基因5’侧翼区序列缺失质粒的构建：以重组质粒pGL3-B8为模板，PCR扩增目的片段B1-B7，同构建重组质粒pGL3-B8的方法一样，得到7个重组质粒，分别命名为pGL3-B1、pGL3-B2、pGL3-B3、pGL3-B4、pGL3-B5、pGL3-B6、pGL3-B7；(4)细胞培养：Raji、KM3细胞悬浮生长于含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，培养基中含100U/ml青霉素、100U/ml链霉素，置于5％CO₂，37℃恒温培养，1～2d传代一次；(5)重组报告基因质粒瞬时转染细胞：Raji、KM3两种细胞各分为11组：(1)pGL3-B1组；(2)pGL3-B2组；(3)pGL3-B3组；(4)pGL3-B4组；(5)pGL3-B5组；(6)pGL3-B6组；(7)pGL3-B7组；(8)pGL3-B8组；(9)pGL3-Control组；(10)pGL3-Basic组；(11)无质粒空白对照组，各组均以psv-β-gal质粒作为内参照，将构建的pGL3-B1、pGL3-B2、pGL3-B、pGL3-B4、pGL3-B、pGL3-B6、pGL3-B7、pGL3-B8八种重组质粒以及阴性对照pGL3-Basic，阳性对照pGL3-Control，分别转染Raji、KM3细胞，同时共转染psv-β-gal内参质粒，空白对照组不转染任何质粒；在转染48h后对各组分别收集并裂解细胞，进行荧光素酶活性检测。