[发明专利]重组毕赤酵母工程菌的构建及其应用

摘要

重组毕赤酵母工程菌的构建及其应用，涉及一种微生物重组构建方法及应用。将杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶插入pPIC9K，构建出重组载体pPIC9K-bgl，然后将重组载体pPIC9K-bgl线性化导入巴斯德毕赤酵母，经筛选得一株最优重组菌株，命名为GS115/pPIC9K-bgl。所构建的毕赤酵母工程菌表达杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶活力为1125IU/mL，蛋白表达量为1.22g/L。该酶具有酸碱稳定性、热稳定性好及催化pH范围广等优点，在酸性环境中的热稳定性大大高于单一的野生型β-葡聚糖酶，其最适反应pH为6.0，最适反应温度为50℃，具有较好的工业应用前景。

主权项

1.重组毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：1)杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的获取从重组大肠杆菌XM-LU中提取质粒pXMLu，以质粒pXMLu为模板，设计引物如下：上游引物BGL1：5’--CG GAATTC ATG AAA CGA GTG TTG CT--3’，下游引物BGL2：5’--AT GCGGCCGC ACC ATG AAA CGA GTG TTG CT--3’，在杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因两端分别引入EcoR I和Not I两个酶切位点，PCR扩增得大小为717bp的杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因；2)巴斯德毕赤酵母表达载体的构建将获得的杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因用EcoR I和Not I双酶切，将双酶切后的杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因与经过EcoR I和Not I双酶切的载体pPIC9K连接，连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，得构建好的重组载体pPIC9K-bgl；3)杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶重组毕赤酵母的构建及筛选将重组载体pPIC9K-bgl线性化导入巴斯德毕赤酵母，经筛选得一株重组菌株，即重组毕赤酵母工程菌。