[发明专利]一种原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶联免疫检测方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种用于检测原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶联免疫检测方法及试剂盒，属于食品安全领域。具体为，酶标板包被两种蛋白抗原，加入两种蛋白混合标准品或样品，再加入两种蛋白混合抗体后，游离的蛋白与酶标板上包被的蛋白竞争抗体，洗涤除去未与酶标板上蛋白连接的抗体，并加入HRP-羊抗兔抗体，反应后，洗涤除去未连接的二抗；加显色液、终止液后，酶标仪测定其吸光度值，对照标准曲线，可得样品中酪蛋白和β-乳球蛋白总含量，根据比例，计算得到牛乳制品中总蛋白含量。本试剂盒是检测方法的一种实现形式，该检测方法具有高特异性、高灵敏度、定量准确、简便等优点，检测线可达108ng/ml，适用于大批样品现场快速检测。

主权项

1.一种对原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶联免疫检测方法，包括以下步骤：(1)包被：Na2CO3-NaHCO3缓冲液，稀释混合蛋白配制混合蛋白包被液，包被96孔酶标板，每孔100μL，4℃放置8小时以上；(2)封闭：弃去包被液，每孔加入150μL封闭液，放置恒温恒湿细胞培养箱37℃，孵育2h以上；(3)抗原抗体反应：弃去封闭液，用洗涤液PBST洗涤；将混合蛋白梯度标准品或待测样品加入酶标板微孔，每孔50μL；再加入混合蛋白抗体，每空50μL，37℃恒温恒湿培养箱，孵育0.5h以上；(4)抗原抗体复合物与酶标二抗反应：弃去反应液，酶标板用PBST洗涤，加入酶标二抗，每孔100μL，37℃恒温恒湿培养箱，孵育0.5h以上；(5)显色：弃去反应液，用PBST洗涤，显色液A与显色液B按600～700∶1比例混合，每孔加入100μL混合显色液，恒温恒湿培养箱37℃，孵育25min；显色液A包括但不限于10mg邻苯二胺溶于25mL 0.05M的磷酸盐-柠檬酸缓冲液，pH值为5.0；显色液B包括但不限于40％双氧水；(6)终止反应：酶标板每微孔加入50μL的1～2mol/L盐酸，终止反应；(7)测定：用酶标仪于492nm波长下测量各孔的吸光度值OD值；(8)根据检测结果绘制标准曲线，横坐标为各标准混合蛋白浓度的对数，纵坐标为抑制率；(9)对照标准曲线，带入线性回归方程，得到酪蛋白-乳球蛋白的总蛋白含量，根据酪蛋白-乳球蛋白占总蛋白含量，得到全蛋白含量。