[发明专利]DSN法直接获得差异表达基因全长cDNA的改良消减杂交方法

摘要

本发明公开了一种DSN法直接获得差异表达基因全长cDNA的改良消减杂交方法，属于基因工程领域，其主要方法是：利用Cap-finder法来合成双链cDNA，实验组和对照组分别进行反转录，实验组用3′poly A尾和5′-GGG帽结构分别在cDNA两端加上序列相同的锚定引物，对照组用普通反转录方法反转录，反转录后的cDNA与实验组的cDNA进行杂交，杂交结束后加入DSN酶进行消化，再进行纯化即获得实验组的差异表达cDNA，利用锚定引物进行PCR扩增，扩增产物分级分离后收集大片段连接T载体，进行转化获得阳性克隆，然后进行斑点杂交，本发明能够一次获取全长差异cDNA。

主权项

DSN法直接获得差异表达基因全长cDNA的改良消减杂交方法，其特征在于：整个步骤总体分为cDNA的合成和差减杂交两个部分，具体步骤如下：1)反转录合成实验组(tester)cDNA一链和二链，mRNA为模板，用3′poly A尾和5′-GGG帽结构分别在cDNA两端加上序列相同的锚定引物，采用带锚定序列的反转录引物，序列为5′-AAGCAGTGGTAACAA C GCA GA GTACT(30)N21N-3′，使cDNA 3′末端引入锚定序列，同时在反应体系中加入根据5′帽结构计的5′锚定引物，序列为5′-AA GCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG-3′，使cDNA 5′末端引入锚定序列，3′和5′的锚定序列是完全相同的，采用无RNA酶H活性的SuperScript II反转录酶作用下合成实验组(tester)cDNA链，同时对照组(driver)cDNA一链和二链用普通反转录方法反转录；2)进行cDNA纯化获得用于杂交的双链cDNA；3)杂交：将步骤(1)中反转录后的对照组cDNA与实验组的cDNA进行杂交；4)DSN处理：准备1/2倍、1/4倍稀释的DSN，冰上放置，68℃预热DSN master buffer，在每个PCR管中加入5μl预热的DSN master buffer，混匀，短暂离心收集，快速地放回68℃，68℃保温10分钟，每管加入10μl终止液(stop solution)，混匀，短暂离心，68℃保温5分钟，将PCR管放到冰上，加入20μl灭菌水，混匀；5)PCR扩增及PCR产物纯化：把DSN处理后的样品进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，再对PCR产物进行普通方法纯化并分级分离后获得实验组的差异表达cDNA；6)cDNA与T载体连接；7)转化与PCR鉴定差减文库的克隆插入片断大小：将上一步骤中cDNA与T载体连接过的cDNA转化获得阳性克隆；8)斑点杂交：采用步骤同传统SSH，对最终获得的序列进行测定和分析。