[发明专利]一种短双链干扰RNA的生成方法

摘要

一种短双链干扰RNA的生成方法涉及一种以T7RNA聚合酶催化体外转录合成短双链干扰RNA，然后采用的酚一氯仿抽提法获得高纯度的短双链干扰RNA的生成方法，属于生物、基因工程技术领域。本发明提供一种操作简便、成本低、目标基因表达效率高的短双链干扰RNA的生成方法。本发明是通过以下技术方案实现的，本发明的方法流程如下：(1)目标基因干扰位置的选择；(2)DNA寡核昔酸链的设计与合成；(3)双链DNA模板形成和体外转录；(4)短双链干扰RNA的分离、提纯。

主权项

一种短双链干扰RNA的生成方法，其特征在于本发明的方法流程如下：(1)目标基因干扰位置的选择：在互联网生物数据库GenBank上查询要干扰基因的mRNA序列，在启始密码子(ATG)75个碱基后寻找AAG开始的20个碱基序列作为目标基因序列。(2)DNA寡核昔酸链的设计与合成：设计合成一条T7启动子DNA寡核苷酸链(18bP)，一条含AAG开始的目标基因正向序列(20bp)和T7启动子反向互补序列(18bP)的DNA寡核苷酸链(38bP)，一条含从G开始的目标基因反向序列(20bp)和T7启动子反向互补序列(18bP)的DNA寡核苷酸链(38bp)。合成：首先18个碱基的T7启动子DNA寡核苷酸同38个碱基的DNA寡核苷酸(含目标基因同源序列和T7启动子寡核苷酸互补序列)退火形成双链DNA，再在T7RNA聚合酶作用下转录生成短双链RNA。(3)双链DNA模板形成和体外转录：将合成的T7启动子DNA寡核苷酸链分别同含目标基因正、反向序列和竹启动子反向互补序列的DNA寡核苷酸链，先在95℃下变性5分钟，然后缓慢降温便得到T7启动子互补的双链DNA，其中目标基因序列为单链。(4)短双链干扰RNA的分离、提纯：首先在短双链干扰RNA的分离、提纯过程中增加了酚/氯仿抽提步骤，采用了酚/氛仿法对合成产物进行了提纯，然后采用无水冷乙醉沉淀RNA，用70％的冷乙醇清洗沉淀后自然干燥，用40μl PBS溶解，在反应体系每次可获得20-40μg短双链干扰RNA。