[发明专利]基于磁珠探针复合物分离短散在重复序列的方法

摘要

本发明公开了一种磁珠探针复合物分离短散在重复序列的方法，本发明包括如下步骤：(1)基因组片段富集库的制备。酶切基因组，回收合适大小片段，T4连接酶加接头，少量接头PCR循环放大酶切后的基因组片段库；(2)探针磁珠复合物的制备。通过引物扩增方法实现生物素标记DNA探针，变性后将生物素标记的单链探针绑定到磁珠上；(3)目的片断群的捕获。将磁珠探针复合物与基因组文库杂交，捕获目的片段并将其分离，克隆及阳性选择。该方法简单、高效、快速，缩短了实验周期，降低了成本消耗，极大的提高了效率，无须特别的实验设备。

主权项

1、一种磁珠探针复合物分离短散在重复序列的方法，其步骤是：(1)基因组片段富集库的制备：酶切基因组后回收片段，T4连接酶加接头，接头PCR循环放大酶切后的基因组片段库，选用HaeIII作为酶切基因组的限制性内切酶，用来生成接头的两条引物分别引物为：A:5P‘GGCAGGATCCACTGAATTCGC-3’和B:5’-AGCGAATTCAGTGGATCCTGCC-3’，其中引物A的5端磷酸化处理，两条寡核苷酸在终浓度为10μM的无菌水中执行如下过程实现两条链的聚合形成接头：95℃3分钟，65℃ 2分钟，45℃ 2分钟，25℃ 1分钟，4℃保存，形成的双链接头一端被磷酸化标记另一端有一个碱基A，使接头定向连接到片段上且阻止第二个接头的继续加入，PCR富集放大酶切后的基因组片段库的使用的循环数为12，并行使用20个PCR反应；(2)探针磁珠复合物的制备：通过一条引物端生物素标记，通过PCR扩增方法实现生物素标记DNA探针，变性后将生物素标记的单链探针绑定到磁珠上，单链磁珠探针的制作包括，首先把步骤(1)中两条引物中的一条引物生物素标记，PCR扩增探针DNA片段回收产物成100μL H2O中，然后95度变性10分钟，插入冰中，然后取200微升磁珠10mg/ml，去掉保存液，用缓冲液TEN100TEN100：10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，1mM乙二胺四乙酸，100mM氯化钠，pH7.5，洗涤三次，每次5分钟，最后用300μL TEN100悬浮磁珠，将上述变性后的生物素标记的探针100μL加入，室温孵育1小时；(3)目的片断群的捕获：将磁珠探针复合物和基因组片段富集库于杂交液中杂交，经上述步骤(2)后，单链探针被绑定到磁珠上，去掉磁珠悬浮液，用200μL杂交液洗一次，再加入150μL10×SSC，0.2％SSC和95度变性后的150微升基因组片段库同时加入悬浮磁珠，55℃杂交2小时，洗脱过程包括：400μL TEN1000：10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，1mM乙二胺四乙酸，1000mM氯化钠，pH 7.5，洗涤三次，每次5分钟，400μL0.2×SSC，0.1％SDS洗涤三次，每次5分钟，最后TEN1000洗一次，10分钟，95度5分钟，期间吹打悬浮磁珠，分离磁珠，接头PCR，通过接头PCR捕获后的片段库，平行做4个PCR反应，捕获的片段库1微升作为模板，15个循环95℃45秒，55℃45秒，72℃1分50秒，反应完成后回收成30微升水中，克隆及阳性选择，通过菌液PCR检测插入片段大小。