[发明专利]人与模式生物功能基因电子克隆的方法

摘要

本发明公开了一种人与模式生物功能基因电子克隆的方法，属于遗传工程技术。该方法包括利用感兴趣的EST片段作为查询探针搜索dbEST库，DNAstar软件进行EST拼接、延伸获得大片段或全长cDNA，获得一致序列，其中包括潜在的核苷酸多态性信息，以获得的一致序列作为查询序列在UCSC服务器上执行BLAT比对分析，拼接外显子等步骤，最后根据预测的功能基因设计PCR引物，通过RT-PCR方法获得cDNA克隆。本发明方法预测结果的可靠性高，对物种并没有特异性，只要被研究的新基因有足够的EST序列信息，且该物种的基因组已经测序，均可以采用该方法进行基因发掘，故具有广泛的适用性。

主权项

1. 一种人与模式生物功能基因电子克隆的方法，具体步骤如下：(1)利用感兴趣的EST片段作为查询探针搜索dbEST库，找到与该序列同源的所有EST序列；(2)分别将EST序列同源的所有EST片段，通过DNAstar软件进行EST拼接、延伸获得大片段或全长cDNA，获得一致序列其中包括潜在的核苷酸多态性信息；(3)以获得的一致序列作为查询序列在UCSC服务器上执行BLAT比对分析，获得包括一个新基因所对应的完整EST序列、mRNA序列和相应基因组图谱序列，以及可能的可变剪切体以及EST表达谱的详细信息；(4)综合上述三个步骤的结果，拼接外显子，最终获得得到GenBankEST数据库和基因组图谱双重支持，同时包含基因可变剪切体、核苷酸多态性以及组织表达等完整信息的cDNA序列；(5)确定新基因编码区序列：生物信息学分析包含候选开放读码框架的cDNA典型基因特征，开放读码框架前有无终止码和启动子，Kozak规则，加尾信号，polyA，进行种属基因的比较基因组分析，通过种属内同源蛋白的氨基酸序列确定该新基因的翻译起始点。(6)根据预测的功能基因设计PCR引物，通过RT-PCR的方法获得目的cDNA克隆并进行序列测定验证。