[发明专利]一种用毕赤嗜甲醇酵母表达重组猪乳铁蛋白N叶的方法

摘要

本发明涉及一种用毕赤嗜甲醇酵母表达重组猪乳铁蛋白N叶的方法，由PLFN基因的扩增、重组酵母表达载体的构建与鉴定、重组酵母表达载体转化酵母细胞PMAD11、Ade⁺Mut^s表型转化子的筛选检测、Ade⁺Mut^s菌株的诱导表达、目的蛋白的纯化与鉴定、目的蛋白表达量的检测、摇瓶及10l发酵罐发酵条件优化及发酵等步骤组成，该工艺生产过程简单，产品纯度高，可以开发为饲料添加剂。

主权项

1.一种用毕赤嗜甲醇酵母表达系统表达重组猪乳铁蛋白N叶的方法，其特征在于，分为以下步骤：1)猪乳铁蛋白N叶基因的扩增：取泌乳母畜乳腺腺泡，液氮冷冻研磨成粉末，提取总RNA并通过反转录得到猪乳铁蛋白N叶的cDNA，根据PLFN基因特征设计一对各带一个酶切位点的引物，利用RT-PCR技术得到DNA，定向克隆入大肠杆菌克隆载体，转化大肠杆菌克隆菌株，筛选阳性克隆。2)重组酵母表达载体的构建与鉴定：将以上筛选出的阳性菌株抽提质粒，用DNA内切酶切出目的基因并纯化，将目的基因定向克隆进用同样的内切酶双酶切过的转移载体，得到含乳铁蛋白N叶基因的重组转移载体，转化大肠杆菌DH5α，涂布在含Amp的LB平板上，培养过夜随即挑取平板上生长的菌落，碱法抽提质粒DNA，双酶切及PCR鉴定。3)重组酵母表达载体转化酵母细胞PMAD11：线性化重组表达载体，在透明的1.5ml聚苯乙烯灭菌管中加入下列试剂：75.0μl重组表达载体，终浓度达1.0μg/μL；3～5μL线性化酶，20.0μL缓冲液；轻轻混匀，37℃下放置12～16小时；在此期间根据Invitrogen Pichia Expression Kit进行酵母菌PMAD 11感受态的制备，取出10μL与1～3μg上述线性化的重组表达质粒混合液，转入0.2cm电转杯，冰浴5分钟，于Bio Rad Gene Pulser电转仪在750V，25μF，∞Ω条件下电转化后，立即加入1mlYPAD在28～30℃静止培养1小时，1500g室温离心3分钟，小心倒净上清，沉淀重悬于100μL的1XYNB，取50μL菌液涂布于MD选择平板上，于28～30℃条件孵育3～4天，观察转化子的生长。4)Ade+Muts表型转化子的筛选检测：将转化菌落分别对应地点在MM和MD选择平板上，筛选在MM平板上生长缓慢而在MD平板上生长良好的菌株；接种单菌落于5ml YPD液体培养基中，28～30℃培养16～20小时后离心，收集菌体，提取酵母基因组，并以提取的酵母基因组DNA作模板进行PCR反应，反应条件如下：94℃预变性2分钟，94℃50s，55℃30s，72℃2分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟；两条引物分别为F：5’-GCGAATTCATGAAGCTCTTCATCCCCGCC-3’，R：5’-CCGGATCCCAGGCCCTGGATGGCAGTA AG-3’。5)Ade+Muts菌株的诱导表达：接单菌落于10～50ml BMDY液体培养基中，28～30℃培养16～18个小时，培养至OD600＝2～10，离心收集菌体，用5mlBMMY培养基重悬，在28～30℃，250rpm进行培养4天，在诱导过程中，每24小时加1次甲醇，终浓度为0.5％，在0，24，36，72，96小时等时间点取500μL发酵液，离心去除菌体，10％SDS-PAGE及Western blot鉴定分析产物。6)目的蛋白的纯化及含量检测：将72h发酵液在4℃下10000rpm离心15min，去除菌体及不溶物，在上清中加入51％硫酸铵，4℃过夜沉淀，8000rpm离心10min，收集沉淀溶解于适量缓冲液A(平衡缓冲液)中，用0.45μm滤膜过滤后待上样；按照操作说明书装好镍离子金属螯合亲和层析柱，用10倍介质体积的缓冲液A平衡亲和柱后上样；待样品用10倍介质体积缓冲液A洗去层析柱中未结合蛋白；采用最高收率洗脱方案：先用10倍介质体积含20mM咪唑的缓冲液D洗脱，再用10倍介质体积含250mM咪唑的缓冲液D洗脱，10％SDS-PAGE及Western blot鉴定分析产物，一抗为鼠抗his单克隆抗体，二抗为碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG；采用BCA法对纯化产物进行检测并计算目的蛋白表达量。7)摇瓶发酵条件优化。在摇瓶发酵环境中通过单因素试验设计，改变发酵基础培养基中一种营养成分的种类或用量，其它营养成分种类和用量不变，优化表达目的产物的基因工程菌发酵条件。通过单因素试验筛选出了最佳的碳源、氮源、碳源添加量、C/N。在单因素试验的基础上，试验设计了L16(45)正交优化试验，通过摇瓶发酵培养筛选出了最适重组菌株蛋白表达的发酵培养基。此外，试验还对影响重组菌株蛋白表达的相关因素(初始pH值、接种量)进行了选择性优化，确定了摇瓶发酵培养条件。摇瓶发酵的最适合培养基及其添加量：最佳碳源葡萄糖(20g/L)、最佳氮源蛋白胨(20g/L)、生物素4mL/L(4×10-5％)、MgSO4.7H2O添加量为5g/L和KH2PO4添加量3g/L。在250ml三角瓶中装入50ml培养基，发酵温度为30℃、摇床转速为250rpm的条件下，发酵前24h pH值为4.5、24h后pH值设为5.0，接种种龄为13h，种子培养液的接种量为4％的条件下，对摇瓶发酵环境中目的蛋白表达最为适宜。在此发酵条件下经反相高效液相色谱检测，重组菌株目的蛋白表达量为5.8μg/mL。8)10L发酵罐发酵条件优化。利用10L发酵罐研究了影响重组菌株生长和目的蛋白表达的发酵工艺参数，通过分批发酵，选择性地研究了机械搅拌转速、初始pH值和温度，对发酵过程中重组菌株菌体生长和目的蛋白表达的影响，研究确定了重组菌株在10L发酵罐中的相关发酵工艺参数。研究了不同的甲醇添加方式对试验菌株生长和目的蛋白表达量的影响，确定了最佳补料方式。结果表明，试验菌株在10L发酵罐中最佳发酵参数：机械搅拌转速为300～350rpm，采用分段控制策略，36h前采用350rpm，36h后采用300rpm；发酵初始pH值4.8；发酵温度28～30℃，发酵前24h选择较适宜菌体生长的温度30℃，24h后选择28℃；通气比为1.0vvm。发酵24h后，每12h向发酵罐中补充0.25％的甲醇，用于试验菌株目的蛋白诱导。在发酵工艺参数优化后的10L发酵罐中，经检测重组菌株目的产物表达量为10.0μg/mL。