[发明专利]一种检测单核苷酸多态性的方法

摘要

本发明提供一种联合内切酶和外切酶以及质谱法方法来检测单核苷酸多态性的新方法。本发明要点在于参与PCR反应的其中一条引物含限制性内切酶的识别位点，通过对PCR产物进行限制性内切酶消化，以及随后的双链DNA外切酶消化，产生两个含多态位点的单链核苷酸片段，并通过纯化、点靶等步骤，制备可直接用于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测的样本。与现有方法相比，本发明具有存在耗时短、成本低、分辨率高、操作简便的优点。

主权项

1、一种联合限制性酶切法和质谱法以检测单核苷酸多态性的方法，包括以下步骤：(1)确定SNP位置：针对待检核酸序列可能存在的SNP，确定SNP在待检序列中的位置；(2)设计正向引物：根据SNP的位置，设计正向引物，其中正向引物3’端位于SNP位点5’端1-10bp处，正向引物5’端含有特殊限制性内切酶的识别位点，而在待检核酸序列中，所述的特殊限制性内切酶的酶切位点位于识别位点的3’端1-10bp，并位于SNP位点5’端1-5bp；(3)设计反向引物：根据SNP的位置，设计与另一条核酸链或互补链上的SNP位点的5’端序列互补的反向引物；(4)PCR扩增：通过PCR扩增，获得包含特殊限制性内切酶的识别位点+酶切位点+SNP位点+SNP位点的部分下游序列的扩增产物；(5)限制性内切反应：使用所述的特殊限制性内切酶进行限制性内切反应，获得具有粘性末端的双链核酸片段，其中粘性末端中包含SNP位点；(6)双链DNA外切反应：利用双链DNA核酸外切酶，切下双链核酸片段的粘性末端，获得两条包含SNP位点并且互补的单链短片段；(7)质谱检测：将包含SNP的单链短片段进行质谱检测，通过与野生型单链短片段的分子量进行比较，确定SNP的基因型。