[发明专利]提高植物吸收和耐受甲醛的方法及其植物表达载体与应用

摘要

本发明公开了一种提高植物吸收和耐受甲醛的方法及其植物表达载体与应用，属植物基因工程技术领域。本发明提供的方法是在植物叶片细胞的叶绿体中导入含DAS和DAK双基因，从而构建一条甲醛同化途径，建立利用植物光合作用同化甲醛的机制，使进入植物细胞中的甲醛能脱毒，创造出具有净化和治理室内空气中甲醛污染的特殊功能观赏植物，维护人体的健康。本发明提供的植物表达载体是pK2－35S－PrbcS－*T－DAS载体和pH2－35S－PrbcS－*T－DAK载体。本发明的应用所获得的植物，与对照植物相比，在有甲醛污染的环境中，不仅长势好，而且吸收甲醛的量增加20％～70％，吸收甲醛的速度提高16％～27％。

主权项

1、提高植物吸收和耐受甲醛的方法，该方法包括以下步骤：(1)、DAS的重组载体pK2-35S-PrbcS-*T-DAS的构建1)假丝酵母DAS的基因的扩增从GenBank中查找假丝酵母DAS的全长基因序列，其GenBank登录号为AF086822，并设计序列如下的一对引物：DAS5：caccgcATGcCTCTCGCAAAAGCTGCTTCDAS3：ggatccTTATTGATCATGTTTTGGTTTTTC5’端引物DAS5，末端加caccgc特征序列，并将ATG后的G改为c由此形成SphI酶切位点；3’端引物DAS3，末端加BamHI酶切位点；以假丝酵母的基因组DNA为模板扩增，得到DAS的全长DNA；2)、DAS基因的TA克隆回收并纯化DAS全长基因片段，并将其连接到pMD18-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD-DAS；3)、入门载体pENTR*-PrbcS-*T-DAS的构建用SphI和BamHI切割pENTR*-PrbcS-*T-GFP和pMD-DAS，回收载体pENTR*-PrbcS-*T片断和DAS基因片断，用T4DNA连接酶连接PENTR*-PrbcS-*T和DAS基因片断，获得入门载体pENTR*-PrbcS-*T-DAS；4)、DAS基因植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-DAS的构建通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-*T-DAS亚克隆到植物表达载体pK2GW7中，获得DAS基因的植物表达载pK2-35S-PrbcS-*T-DAS，其DAS基因的GenBank登录号为AF086822重组载体pK2-35S-PrbcS-*T-DAS，DAS基因上游添加有光诱导型启动子PrbcS和叶绿体定位序列*T，其后紧接DAS基因；(2)、DAK基因重组载体pH2-35S-PrbcS-*T-DAK的构建1)、毕赤酵母DAK的基因的扩增从GenBank中查找巴斯德毕赤酵母DAK的全长基因序列，其GenBank登录号为AF019198，并设计序列如下的一对引物：DAK5：CACCGCatgCctagtaaacattgggattacDAK3：CTCGAGctacaacttggtttcagatttg5’端引物DAK5，末端加caccgc特征序列，并将ATG后的t改为C由此形成SphI酶切位点；3’端引物DAK3，末端加XhoI酶切位点；以巴斯德毕赤酵母的基因组DNA为模板扩增，得到DAK的全长DNA；2)、DAK基因的TOPO克隆回收并纯化DAK基因片段，通过TOPO克隆技术亚克隆到pENTR-TOPO载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和测序分析获得重组质粒pENTR-TOPO-DAK；3)、入门载体pENTR*-PrbcS-*T-DAK的构建用SphI和XhoI切割pENTR*-PrbcS-*T-GFP和pENTR-TOPO-DAK，回收载体pENTR*-PrbcS-*T片断和DAK基因片断，用T4DNA连接酶连接PENTR*-PrbcS-*T和DAK基因片断，获得入门载体pENTR*-PrbcS-*T-DAK；4)、DAK基因植物表达载体pH2-35S-PrbcS-*T-DAK的构建通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-*T-DAK亚克隆到植物表达载体pH2GW7中，获得DAS基因的植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-DAK，其DAK基因的GenBank登录号为AF019198；重组载体pK2-35S-PrbcS-*T-DAK中DAK基因的上游添加有光诱导型启动子PrbcS和叶绿体定位序列*T；(3)、农杆菌的遗传转化和转化子的检测制备农杆菌的感受态细胞，用电脉冲法将上述构建好的植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-DAS和pH2-35S-PrbcS-*T-DAK转入农杆菌中，在加有壮观霉素的平板上筛选转化子菌落；以农杆菌菌落的裂解液作为PCR反应的模板，用DAS和DAK基因的上下游特异性引物作PCR检测转化子菌落，经菌落PCR确认的转化子菌落用于转化植物；(4)、用含有DAS和DAK基因植物表达载体的农杆菌转化植物分别挑取携带有质粒pK2-35S-PrbcS-*T-DAS和pH2-35S-PrbcS-*T-DAK的农杆菌单菌落接种于液体LB培养基中培养，离心收集菌体，再用MS液体培养基悬浮。用悬浮的农杆菌感染容易分化的植物组织，然后通过组织培养获得小苗，再利用抗生素筛选获得转基因植物；(5)、DAS和DAK基因在转基因植物中的插入情况和转录水平的检测用PCR方法对筛选到的转基因植物作进一步的鉴定；首先采用CTAB法提取转基因植物的基因组DNA，然后以植物基因组DNA为模板，用DAS基因和DAK基因的上下游特异性引物作PCR检测，经PCR确认的转基因植株用于RT-PCR分析；从转基因植物中抽取总RNA，反转绿成cDNA后用于RT-PCR分析，检测DAS基因和DAK基因在转基因植物中的转录水平；采用TRIzoL Reagent(Invitrogen)提取RNA，以cDNA为模板，用DAS和DAK基因上下游特异性引物作PCR，经RT-PCR确认的转基因植株用于植物对甲醛的抗性和吸收速率的检测。