[发明专利]一种转基因水稻制剂的制备方法和用途

摘要

本发明公开了一种转基因水稻制剂的制备方法和用途，其步骤是：A.水稻胚乳特异性启动子及信号肽的获得；B.水稻胚乳细胞特异性表达载体的构建；C.融合蛋白和目的基因的密码子优化与基因合成；D.融合蛋白表达载体pOsPMP26的构建；E.水稻基因遗传转化；F.高表达转基因植株的筛选；G.转基因水稻种子的加工，经制片机加工成口服片剂和口服冲剂；一种转基因水稻制剂在制备治疗或预防糖尿病和高血糖症的药物中应用。本发明方法易行，操作方便，制剂成本低，服用方便，安全、无毒、疗效好。

主权项

1、一种转基因水稻制剂的制备方法，其步骤是：A、水稻胚乳特异性启动子及信号肽的获得：为了获得水稻胚乳特异性表达的启动子和信号肽，采用水稻储藏蛋白的醇溶谷蛋白基因家簇中的一个成员Gt13a基因的启动子，为了获得Gt13a启动子和它的信号肽序列，根据基因数据库的Gt13a合成了一对核苷酸引物用于PCR扩增，在正向引物的5’端加入了一个粘性末端的酶切位点，在反向引物的5’端加了一个平末端的酶切位点，从水稻品种中提取基因组DNA，以DNA为模版，按照PCR程序，利用上述引物扩增出了一个1284碱基的DNA片段，得到了一种重组蛋白在谷物胚乳中表达的启动子和信号肽；B、水稻胚乳细胞特异性表达载体的构建：经PCR获得Gt13a启动子和信号肽的序列后，PCR产物经粘性末端和平末端内切酶消化后，将这个片段与经粘性末端和平末端内切酶消化的pBI221片段连接，然后导入大肠杆菌品系DH10B，形成了含有Gt13a启动子、Gt13a信号肽和Nos终止子的水稻胚乳特异性表达的载体，并将这个载体质粒为pOsPMP2；C、融合蛋白和目的基因的密码子优化与基因合成：从技术信息中心基因库里获得了水稻Bip和人类胰岛素生长因子-1基因的氨基酸序列，由DNA分析软件马克载体将基因的氨基酸序列转换成含有水稻遗传密码子的核苷酸序列，这种经水稻密码子的水稻Bip基因的C末端片段和一种经水稻密码子的人IGF-1基因，在人工合成基因时，在基因合成的引物5’和3’末端分别加上平末端和粘性末端的限制性内切酶；D、融合蛋白表达载体pOsPMP26的构建：用限制性内切酶NaeI和NcoI消化pOsPMP3质粒DNA，将PCR扩增的BipCDNA片段克隆到pOsPMP3质粒载体，形成了水稻种子特异性表达的融合蛋白表达载体pOsPMP26；E、水稻基因遗传转化：水稻种子去壳后，在20％次氯酸钠中消毒，用灭菌水漂洗，然后在愈伤组织诱导培养基上诱导20-25天，诱导的愈伤组织转移到预处理培养基上生长9-10天后，用于遗传转化，将0.5微克的表达载体质粒pOsPMP26和质粒pOsPMP5的DNA，与50微升的金粉、250微升的1M氯化钙和50微升的0.1M亚精胺混合后，反应，用酒精洗三次，将DNA包裹在金粉上，然后按照基因枪方法，将两个质粒共转化到台北309产生的愈伤组织，在含有潮霉素B的选择培养基上经45天的筛选，潮霉素B抗性的愈伤组织在再生培养基上，在光照下经20天的诱导，愈伤组织分化成绿色植株，然后将植株转到生根培养基上，经15-20天的诱导，形成植株，获得转基因植株；F、高表达转基因植株的筛选：转基因水稻经过4个月的生长和发育，抽穗开花后，经一个月的时间，形成成熟的转基因水稻T1代种子，当T1种子收获后，从水稻成熟胚乳的提取物，采用蛋白质印迹法，筛选转基因单株，从T1种子中筛选表达融合蛋白高的转基因个体，经T1代的继续选择，形成稳定表达融合蛋白的转基因品系；G、转基因水稻种子的加工：转基因水稻成熟后，收割，经谷物砻谷机去壳后形成糙米，然后将糙米碾磨成60-80目的米粉，经制片机加工成转基因水稻制剂。