[发明专利]一种多环芳烃厌氧降解酶蛋白的提取与纯化方法

摘要

本发明属于生物工程技术与难降解有机污染物生物处理技术领域的一种多环芳烃厌氧降解酶蛋白的提取与纯化方法。将多环芳烃厌氧降解菌配制成菌悬液后进行厌氧扩增培养，然后超声波破碎分离出菌体和上清液。向分离出的菌体中加入去离子水后进行超声波破碎，分离出菌体和上清液，重复2次。合并3次所收集的上清液，得到多环芳烃厌氧降解酶蛋白粗提液。在厌氧箱中向酶蛋白粗提液中加入碾细的(NH₄)₂SO₄固体至45％～85％饱和度，密封后振荡1～2h，然后离心分离出沉淀。将沉淀溶于少量缓冲液并装入透析袋中透析24h。将透析后的样品离心得到上清液。将上清液上到阴离子交换柱上过滤，采用内含0.0～0.30mol/L线形洗脱梯度氯化钠的缓冲液洗脱结合的酶蛋白，收集280nm处吸光度大于0.01的洗脱液。测定酶蛋白的活性，选择活性部分备用。本发明具有工艺简单、操作简便、对设备要求低、成本低、得率高等优点。

主权项

1.一种多环芳烃厌氧降解酶蛋白的提取与纯化方法，其特征在于，该方法的具体步骤如下：①将4℃冰箱中保存的多环芳烃厌氧降解菌配制成浓度为1×108个/ml的菌悬液，向已加入198ml诱导培养基、2.0ml微量金属液和0.2ml维生素c溶液的厌氧瓶内接种2ml菌悬液，为去除培养基中的氧，诱导培养基、微量金属液和维生素溶液在加入之前用高纯氮气曝气3.5h。然后用氟化橡胶塞密封瓶口，并用螺旋瓶盖拧紧。将厌氧瓶在培养温度为25～30℃、转速为100r/min的振荡器中培养25d后即可得到扩增培养后的多环芳烃厌氧降解菌混合液。②将步骤①中的多环芳烃厌氧降解菌混合液进行超声波破碎15min。破碎后的降解菌混合液在8000r/min条件下离心15min，在厌氧箱中分离出菌体和上清液。③在厌氧箱中向由步骤②分离出的菌体中加入30ml用高纯氮气曝气3.5h后的去离子水，用氟化橡胶塞密封瓶口并用螺旋瓶盖拧紧后继续进行超声波破碎，在8000r/min条件下离心15min，在厌氧箱中分离出菌体和上清液。④在厌氧箱中向由步骤③分离出的菌体中加入30ml用高纯氮气曝气3.5h后的去离子水，用氟化橡胶塞密封瓶口并用螺旋瓶盖拧紧后继续进行超声波破碎，在8000r/min条件下离心15min，在厌氧箱中分离出菌体和上清液。⑤在厌氧箱中合并由步骤②、③和④所收集的上清液，即可得到多环芳烃厌氧降解酶蛋白粗提液。⑥在厌氧箱中向由步骤⑤得到的酶蛋白粗提液中加入碾细的(NH4)2SO4固体至45～85％饱和度，用氟化橡胶塞密封瓶口并用螺旋瓶盖拧紧后在转速为100r/min的振荡器中振荡1～2h，然后在8000r/min条件下离心15min，在厌氧箱中分离出沉淀。⑦将由步骤⑥得到的沉淀溶于少量pH值为7.0～7.2的0.05mol/L三羟基甲基氨基甲烷(Tris)-HCl缓冲液并装入透析袋中，将透析袋在pH值为7.0～7.2的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液中透析24h。将透析后的样品在8000r/min条件下离心15min，在厌氧箱中分离出上清液。⑧在厌氧箱中将由步骤⑦得到的上清液上到已用pH值为7.0～7.2的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液平衡的Q Sepharose Fast Flow阴离子交换柱上过滤，采用pH值为7.0～7.2的0.05mol/LTris-HCl缓冲液(内含0.0～0.30mol/L氯化钠)线形洗脱梯度洗脱结合的多环芳烃厌氧降解酶蛋白，洗脱速度为20ml/h。运用容积为10ml的厌氧管收集洗脱液，其中每支厌氧管收集洗脱液5ml。用紫外分光光度计在吸收波长为280nm处检测洗脱液，收集吸光度大于0.01的洗脱液。测定酶蛋白的活性，选择活性部分备用。