[发明专利]建立巴西橡胶树悬浮细胞系的方法

摘要

本发明公开了一种建立巴西橡胶树悬浮细胞系的方法，它包括外植体的准备过程、胚性愈伤组织诱导过程、胚性愈伤组织继代过程、胚性愈伤组织悬浮培养过程。本发明工艺流程简单，生产成本低，建立的悬浮细胞系增殖迅速、稳定、可以长期继代培养，解决了常规巴西橡胶树胚性愈伤组织获得受季节和气候等影响以及规模化增殖和花费大量人力和物力的问题，为巴西橡胶树自根无性系大规模商业化、工厂化生产和大规模大田种植提供了重要基础，为巴西橡胶树利用体细胞杂交、遗传转化和突变体诱导等生物技术方法创造新的优良的种质资源提供了新的途径和条件，为巴西橡胶树生物反应器的研发奠定了基础。

主权项

1.一种建立巴西橡胶树悬浮细胞系的方法，其特征在于：包括外植体的准备过程、胚性愈伤组织诱导过程、胚性愈伤组织继代过程、胚性愈伤组织悬浮培养过程；1)、所述外植体的准备过程是以巴西橡胶树花蕾为外植体，用70-80％酒精对花蕾进行表面消毒30～60秒后，再用0.1％氯化汞消毒10～15分钟，最后用无菌水冲洗3～6次，每次3～5分钟；2)、所述胚性愈伤组织诱导过程是剥出消毒好的花蕾中的雄蕊，接种到诱导愈伤的诱导培养基上于25～28℃的温度进行暗培养，培养40～60天；所述诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，将MS培养基中的磷酸二氢钾、无水氯化钙、四水硫酸锰和七水硫酸镁的含量调整为磷酸二氢钾350-500mg/L、无水氯化钙150-400mg/L、四水硫酸锰10-40mg/L、七水硫酸镁400-600mg/L，并添加2，4-D0.5～3mg/L、KT 0.5～3mg/L、NAA 0.5～3mg/L、Phytagel 2～3g/L、蔗糖50～90g/L、椰子水40-60ml/L；3)、所述胚性愈伤组织继代过程是将经过诱导的胚性愈伤组织在诱导培养基上继代培养2～4次，每7～10天一次，暗培养，温度为25～28℃；4)、所述胚性愈伤组织悬浮培养过程是将继代后的愈伤组织破碎成0.2～0.5cm颗粒，然后将2～6g愈伤组织颗粒接种到含20～60ml液体培养基的三角瓶中，置于90～110r/分钟的摇床上，在温度为25～28℃，暗培养，每7～10天继代一次，继代3～8次后，将大块的愈伤组织去掉，将小的愈伤和细胞继续继代培养，即获得悬浮细胞系；所述液体培养基是以MS培养基为基础培养基，将MS培养基中的磷酸二氢钾、无水氯化钙、四水硫酸锰和七水硫酸镁的含量调整为磷酸二氢钾350-500mg/L、无水氯化钙150-400mg/L、四水硫酸锰10-40mg/L、七水硫酸镁400-600mg/L，并添加2，4-D 0.5～3mg/L、KT0.5～3mg/L、NAA 0.5～3mg/L、蔗糖50～90g/L、椰子水40-60ml/L。