[发明专利]一种用于检测副溶血弧菌的方法

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种用于检测副溶血弧菌的方法，其特征在于：DNA模板的制备为细菌纯培养物离心，弃上清液、加入100μL无菌水后水浴，后冰浴、再离心，取上清液备用，作为模板进行扩增；采用primer primer5.0引物软件针对副溶血弧菌tlh基因M36437设计LAMP引物中4条引物序列；采用副溶血弧菌的环介导等温扩增：配置25uL反应体系、温育、灭活；产物检测：肉眼观察反应体系的浊度。本发明与现有技术相比，检测方法简便、可靠、灵敏度高，耗时短，成本低廉，是简易的常规检测手段，尤其适用基层检验检疫机构及养殖场，对提高食品卫生水平和推动食品国际贸易发展具有重要的意义。

主权项

1.一种用于检测副溶血弧菌的方法，包括DNA模板的制备、采用引物设计软件设计LAMP引物以及引物的合成、副溶血弧菌的环介导等温扩增、产物检测，其特征在于：(1)DNA模板的制备：a.取1.0mL细菌纯培养物，置于1.5mL离心管中，以12000转/分离心5分钟，弃上清液；b.加入100μL无菌水，涡旋混匀，100℃水浴10分钟，立即冰浴2分钟；c.12000转/分离心5分钟，取上清液备用，作为模板进行扩增；(2)采用引物设计软件设计LAMP引物为采用primer primer5.0引物软件针对副溶血弧菌tlh基因M36437设计LAMP引物，设计的LAMP引物序列为：正向内引物FIP：5’-GCCCATTCCCAATCGGTCG-TTTT-CTATGTTTCGCTGTTGGTATCG-3’；反向内引物BIP：5’-GTTCTACACCAACACGTCGCA-TTTT-TCGCCAAATCTAATGTTGCTTC-3；正向外引物F3：5’-CAGCACGCAAGAAAACCA-3’；反向外引物B3：5’-ATTGTCAGCGGCGAAGAA-3’；(3)采用副溶血弧菌的环介导等温扩增：a.配置25uL反应体系，包括：100mM的MgSO4 1.5uL、10mM的dNTP 2.5uL、5M的betaine 4uL、20uM的正向内引物FIP 1.5uL、20uM的反向内引物BIP 1.5uL、10uM的正向外引物F3 0.5uL、10uM的反向外引物B3 0.5uL、8000U/mL的Bst DNA聚合酶大片段1uL、10×ThermoPol buffer 2.5uL、DNA模板2uL、ddH2O 7.5uL；b.混匀反应体系，于60℃温育60分钟；c.80℃灭活10分钟；(4)产物检测：肉眼观察反应体系的浊度变化或5000 rpm离心反应体系10s后，观察反应管底部，若体系混浊或反应管底部出现白色沉淀，则待检细菌为副溶血弧菌，若否，则待检细菌不是副溶血弧菌。