[发明专利]添有扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法

摘要

本发明涉及的是食品安全技术领域的一种添有扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法。本发明具体步骤如下：(1)设计特异引物。(2)通过对MgCl₂浓度和退火温度Tm值进行优化选择，使PCR反应体系处于最优的反应条件。(3)选择对检测灵敏度影响最小且能够明确指示假阴性的扩增内标的浓度作为添加浓度。(4)进行PCR检测，确定引物的特异性及扩增内标在非沙门氏菌样品检测中是否能够正常扩增。(5)建立的PCR反应体系，通过对人工污染样品和自然污染的样品进行检测。本发明有助于PCR检测体系能够显示假阴性的发生，避免了因样品中存在的抑制剂或操作失误所导致检测结果呈现假阴性而作出的结果误判，从而提高PCR检测的准确率。

主权项

1、一种添有扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)利用沙门氏菌自身的特异基因序列构建扩增内标，设计特异引物；(2)首先，根据引物设计时推荐的Tm值，在Tm±5℃范围内以1℃间隔设置温度梯度，根据扩增产物在电泳图中的亮度来选择退火温度，在确定退火温度后，在反应体系中选择PCR反应体系的Mg2+浓度；(3)进行PCR检测，选择PCR的检测灵敏度，然后，取带有扩增内标的载体，添加到PCR反应体系中，反应体系中添加不同稀释浓度的扩增内标，再次，检测DNA或菌株的灵敏度，选择对检测灵敏度影响最小且能够明确指示假阴性的扩增内标的浓度作为添加浓度；(4)提取不同血清型的沙门氏菌标准菌株和不同种属的非沙门氏菌标准菌株的DNA，进行PCR检测，确定引物的特异性及扩增内标在非沙门氏菌样品检测中是否能够正常扩增；(5)通过检测人工污染样品判断扩增内标是否指示假阴性；检测自然污染样品，同时采用国标方法和API试剂条的检测结果进行参比，来评价建立的PCR检测体系的检测结果是否准确。