[发明专利]基于硫代修饰的连接酶非依赖性基因克隆方法

摘要

本发明涉及一种基于硫代修饰的连接酶非依赖性基因克隆方法，其中扩增目标基因与质粒载体的引物的5’端第11－21位间的某一磷酸二酯键为硫代修饰；目标基因的正向引物和载体的反向引物，目标基因的反向引物和载体的正向引物，每对引物5’端至硫代修饰上游第2位的连续碱基序列互补配对。PCR扩增目标基因与质粒载体后，纯化PCR产物。5’外切核酸酶从5’端降解DNA链，硫代修饰与5’外切核酸酶消化DNA双链的共同作用会生成长10－20个核苷酸的3’单链突出端。由于目标基因与质粒载体的3’突出端碱基序列互补，形成稳定的完全配对双链，不需要进行DNA连接反应，直接转化大肠杆菌。本发明目标基因克隆不依赖于限制性核酸内切酶与DNA连接酶，操作通量大，可用于大规模基因克隆。

主权项

1、一种基于硫代修饰的连接酶非依赖性基因克隆方法，其特征在于包括以下步骤：1)设计合成用于扩增目标基因与质粒载体的引物序列；引物序列的特征是：(1)5’端第11-21位间的某一磷酸基团为硫代修饰；(2)扩增目标基因的正向引物的5’端第1位至硫代修饰上游第2位间的连续碱基序列与扩增质粒载体的反向引物的5’端第1位至硫代修饰上游第2位间的连续碱基序列互补配对，扩增目标基因的反向引物的5’端第1位至硫代修饰上游第2位间的连续碱基序列与扩增质粒载体的正向引物的5’端第1位至硫代修饰上游第2位间的连续碱基序列互补配对；(3)3’端下游碱基序列与待扩增DNA片段两端碱基序列配对；2)将用于扩增目标基因与质粒载体的正向引物与反向引物、目标基因与质粒载体的DNA模板分子、DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸的混合物dNTPs加入聚合酶链式反应缓冲液，进行反应；3)对扩增的线性化质粒载体PCR产物，先用DNA限制性核酸内切酶DpnI消化去除质粒模板；分别回收目标基因与经Dpn I处理的线性化质粒载体的PCR扩增产物；4)5’外切核酸酶处理PCR扩增的目标基因与线性化质粒载体DNA片断，5’外切核酸酶特异性从5’端降解双连DNA的一条DNA链，DNA中的硫代修饰阻断5’外切核酸酶消化，因此经5’外切核酸酶消化使得DNA片段的两端产生长为10-20个核苷酸的3’突出端；5)将5’外切核酸酶消化的两种DNA片断混合，使二者的3’突出端杂交配对，形成含目标基因的带缺口重组质粒；6)将含目标基因的带缺口重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，37度培养，修复重组质粒中的缺口，形成含目标基因的完整重组质粒；7)利用扩增目标基因的引物与Taq DNA聚合酶进行菌落PCR，鉴定含目标基因的完整重组质粒的阳性克隆，从阳性克隆中抽提含目标基因的完整重组质粒DNA。