[发明专利]豌豆白蛋白亚组分PA1b重组蛋白及其制备方法和应用

摘要

本发明属于基因工程和生物杀虫剂的技术领域，提供了一种豌豆白蛋白亚组分PA1b重组蛋白及其制备方法，该方法包括重组蛋白生产的基因工程菌构建；重组蛋白的发酵生产；重组蛋白的分离纯化。本发明还提供了上述豌豆白蛋白亚组分PA1b重组蛋白在制备防治储粮害虫的生物杀虫剂中的应用。本发明通过独特的工艺，简便的方法，使豌豆白蛋白亚组分PA1b基因的规模化生产成为现实。毕赤酵母表达PA1b的成本低，产量高，分离纯化工艺简便。

主权项

1、一种豌豆白蛋白亚组分PA1b重组蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)重组蛋白生产的基因工程菌构建：设计上游引物Xho I-PA-F：5′-CTC TCG AGA AAA GAG AGG CTG CTTCTT GCA ACG GTG TTT G-3′，下游引物Not I-PA-R：5′-GAT CTC AGT GGTGGT GGT GG-3′；以豌豆cDNA文库为模板，进行RT-PCR扩增获得目的基因片段，目的基因片段与表达载体pPICZαA/B/C经内切酶Xho I和Not I双酶切后连接，构建表达产物的重组质粒pPICZαA/B/C-1b；重组质粒pPICZαA/B/C-1b经Sal I处理成线状后，采用电转化的方法将其导入毕赤酵母细胞，在含Zeocin选择压力的YPD培养基中，筛选具有目的蛋白表达能力的基因工程转化菌；(2)重组蛋白的发酵生产：第一步，富集菌体：基因工程转化菌接种到MGYH液体培养基中，在25～30℃下培养至A600为2.6；在室温下，将发酵液进行低速离心，收集细胞；第二步，诱导重组蛋白表达：将上一步收集的细胞用BMMH液体培养基重新悬浮细胞至A600为0.1，然后培养，诱导抗虫蛋白表达，每24h添加100％甲醇至甲醇浓度为0.5％，维持诱导压力，促使重组蛋白表达；(3)重组蛋白的分离纯化：经甲醇诱导重组蛋白表达的发酵液离心除去细胞后，上清液采用Ultrafree-15超滤膜分离，滤液采用HPLC分离，收集滞留时间为28～30min的分部组分真空干燥，经冷冻干燥获得豌豆白蛋白亚组分PA1b重组蛋白。