[发明专利]鱼类异源冷冻精子诱导雌核发育的方法

摘要

一种鱼类异源冷冻精子诱导雌核发育的方法，包括异源鱼类精子的冷冻保存和遗传失活、雌核发育二倍体鱼苗的诱导和雌核发育鱼苗的鉴定方法。本发明首次建立了采用花鲈冷冻精子诱导多种海水鱼类卵子雌核发育的方法，筛选到分别适合条斑星鲽、大菱鲆和犬齿牙鲆鱼卵的冷休克起始时间、冷休克温度和冷休克持续时间，建立了雌核发育鱼苗的微卫星标记鉴定方法。采用本发明方法获得条斑星鲽、大菱鲆和犬齿牙鲆雌核发育鱼苗的百分率分别为7.8－40.7％，26－34％和10－25％。本发明建立的方法具有先进、高效、准确、可靠的特点，在鱼类性别控制和全雌苗种生产中具有重要应用价值，在鱼类养殖和育种上具有广阔的推广应用前景。

主权项

1.一种异源冷冻精子诱导鱼类雌核发育的方法，其特征在于它的操作方法包括：1)、异源鱼类冷冻精子的遗传失活；2)、雌核发育二倍体鱼苗的诱导；3)、雌核发育鱼苗的鉴定：1)、异源鱼类冷冻精子的遗传失活：通过染色体分析比较和杂交授精实验确定花鲈精子可以有效刺激多种鲆鲽鱼类卵子进行雌核发育，为诱导鲆鲽鱼类卵子进行雌核发育的有效异源鱼类精子；采用配方为KCl0.39g/L，CaCl2·2H2O 0.17g/L，NaHCO3 0.25g/L，NaCl 3.59g/L，NaH2PO4 0.22g/L，MgCl2 0.23g/L，Glucose 1.0g/L，DMSO 20％的冷冻稀释液对花鲈精子进行冷冻保存；花鲈精液在液氮中可以进行长期冷冻保存；解冻时，将在液氮中保存的冷冻精液管从液氮中取出来，先在液氮面上平衡5分钟，然后将冻精管拿出来在38℃水浴中解冻后备用；冷冻精子的遗传失活采用紫外线照射完成；选取解冻后精子活力在60-70％以上者用于紫外线失活处理；吸取100μL冷冻解冻的花鲈精液置于在6℃预冷过的直径为10cm的培养皿中，加入900μL不合DMSO的上述精子冷冻稀释液进行稀释，摇匀平辅在直径10厘米的塑料培养皿底部，将装有冷冻精液的培养皿置于10-80mJ/cm2紫外线下照射0.1-0.9min，照射后的精子活力应该保持在20-40％，经这样处理过的精子可以用来诱导鱼卵雌核发育；2)、雌核发育二倍体鱼苗的诱导：选择性成熟的条斑星鲽、大菱鲆或犬齿牙鲆等鲆鲽鱼类雌鱼，在自然产卵前1h采用人工挤压腹部法采卵，将卵采入干燥的烧杯中，根据鱼的种类不同，将采集的鱼卵置于不同的温度下，其中条斑星鲽卵放在8℃，大菱鲆卵放在14℃，犬齿牙鲆卵放在18℃；将以上经过紫外线照射失活的花鲈精液分别加入到条斑星鲽、大菱鲆、犬齿牙鲆鱼的未受精卵中，轻轻摇动混匀，加入2倍于卵量的海水完成“授精”过程，海水温度根据鱼的种类确定，其中条斑星鲽卵授精温度为8℃，大菱鲆卵放在为14℃，犬齿牙鲆卵放在18℃；精液和卵的“授精”最小体积比100μL精液：4-8ml卵，授精过程在250ml烧杯中进行；在授精后不同时间，对受精卵进行冷休克处理；通过大量实验确定适合于我国几种重要海水鱼类雌核发育卵染色体加倍的诱导条件分别为：条斑星鲽：在用紫外线失活的花鲈精子与条斑星鲽卵子“授精”后7-9分钟，将授精卵放在-0.5℃到-1.5℃的水浴中进行冷休克处理，处理时间为60-90min，然后将授精卵置于8℃左右的海水中进行孵化，能够获得雌核发育的二倍体条斑星鲽鱼苗，二倍体雌核发育鱼苗的诱导率为7.8-40.7％；大菱鲆：在用紫外线失活的花鲈精子与大菱鲆卵子“授精”后4-6分钟，将授精卵放在温度为-1-2℃的水浴中进行冷休克处理，冷休克的持续时间为20-30分钟。然后将授精卵置于14℃左右的海水中进行孵化，能够获得雌核发育的二倍体大菱鲆鱼苗；二倍体雌核发育鱼苗的诱导率为26-34％；犬齿牙鲆：在用紫外线灭活的花鲈精子与犬齿牙鲆卵子“授精”后3-5分钟，将授精卵放在温度为1-2.0℃的水浴中进行冷休克处理，冷休克的持续时间为40-50分钟；然后将授精卵置于18℃左右的海水中进行孵化，能够获得雌核发育的二倍体犬齿牙鲆鱼苗；二倍体雌核发育鱼苗的诱导率为10-25％；3)、雌核发育鱼苗的鉴定：染色体分析鉴定雌核发育鱼苗：由于花鲈染色体数目为2n＝48条，其核型为48t，而条斑星鲽染色体数目为2n＝46，其核型为44t+2sm；而大菱鲆染色体数目为2n＝44，其核型为2n＝4m+12st+28t，因此花鲈的染色体数目与这些鱼类不相同，通过染色体分析即可证明雌核发育鱼苗是否为雌核发育而来；如果雌核发育鱼苗的染色体数目及核型与条斑星鲽、大菱鲆或犬齿牙鲆等母本相同，则证明这些鱼苗是雌核发育而来；本发明采用染色体制片技术，对条斑星鲽和大菱鲆等鱼类雌核发育鱼苗进行了染色体分析，发现条斑星鲽雌核发育鱼苗的染色体数为46条，大菱鲆雌核发育鱼苗的染色体数为44条，与母本完全相同，从而证明这些鱼苗为雌核发育二倍体个体；用微卫星标记鉴定雌核发育鱼苗：基因组DNA的提取：将固定于纯酒精中的鱼苗或鱼鳍条剪碎后加入400μl配方为10mM Tris-HCl，pH7.5，400μM NaCl，100mM EDTA，0.6％SDS10mM Tris-HCl，PH7.5，400μM NaCl，100mM EDTA，0.6％SDS的TENS裂解液和10μl浓度为10mg/ml的蛋白酶K，55℃消化完全后，加入140μl饱和氯化钠，混匀，12000rpm/min 4℃离心30min；取上清加入两倍体积预冷的无水乙醇沉淀DNA，然后将絮状沉淀挑出后用70％的酒精洗涤两次，待酒精挥发干后，用TE缓冲液溶解DNA；PCR扩增及结果分析：PCR反应体系为10μl，包括配方为20mM Tris-HCl，pH8.4，20mM KCl，10mM硫酸铵，10-50ng基因组DNA，0.2μM微卫星引物，120μMdNTPs，1.5mM MgCl2和0.5U Taq DNA聚合酶；PCR扩增条件为94℃热变性5min，然后进行38个循环，每个循环包括94℃变性30s，56-62℃退火30s，72℃延伸30s，最后在72℃延伸7min；采用序列为CGAGGAGGGGAAGAAAGAAC和CACAACCCAAGCGCAACTAT的Pade 30微卫星引物，扩增普通犬齿牙鲆基因组DNA时，85％以上的个体扩增出2条DNA带，而当扩增犬齿牙鲆雌核发育鱼苗时，75％以上个体只扩增出1条带；当用序列为CACTGTGCCCACTGTCTG和TTTTCCTCTT ACTCCCTCTCTT的Vmo4微卫星引物扩增普通条斑星鲽基因组DNA时，75％以上的个体扩增出2条DNA片段，而当扩增条斑星鲽雌核发育鱼苗基因组DNA时，90％以上的个体只扩增出1条DNA片段；采用序列为TGGACTGGTTTACTGCTGGA和AGGGAACCGATCTGAGAACA的SmaC03微卫星引物扩增正常大菱鲆鱼苗时，85％以上的个体产生2条DNA带，而当扩增雌核发育大菱鲆鱼苗时，75％以上的个体只产生1条DNA带；因此，这些微卫星标记可以用于鉴定这些鱼类雌核发育鱼苗。