[发明专利]农杆菌介导的国槐转基因及组培快繁方法

摘要

本发明公开一种农杆菌介导的国槐转基因及组培快繁方法，包括(1)种子选择与消毒，(2)根癌农杆菌的选择与培养，(3)组培苗培育，(4)农杆菌侵染，(5)抗性植株选育，(6)转化植株鉴定，(7)转化植株培育，(8)幼苗移栽等步骤；本发明通过选择国槐的特定叶片(大叶片)建立了适宜遗传转化的高频再生体系以及一个可重复的、转化效率高的林木基因转化技术体系，获得了抗盐性提高的转化植株，并建立了配套的组培快繁育苗技术体系；本发明的方法为农杆菌介导的目的基因在木本植物上的转化及包括丛生芽分化、生根和移栽等组培快繁技术提供了依据。

主权项

1.一种农杆菌介导的国槐转基因及组培快繁方法，由以下步骤组成：(1)种子选择与消毒：选用田间生长高大、健壮、无病虫害的成龄大树作为采种树，收集个大、饱满的荚果，取出种子后在室内晾干，阴凉干燥处放置30天后备用；接种前对种子进行消毒；(2)根癌农杆菌的选择与培养：选用含有不同双元载体的根癌农杆菌菌株LBA4404或GV3101；挑选根癌农杆菌单菌落接种于含有卡那霉素50mg·L-1的YEB液体培养基中，25～30℃，振荡转速160～220rpm条件下，培养24～36小时，然后转接于无抗菌素的YEB培养基中以相同条件培养12～24小时，离心，收集菌体，再用pH5.4～5.8的无菌MS液体培养基将菌体稀释至OD600 0.3～0.7，即得可用于侵染的农杆菌菌液，备用；(3)组培苗培育：将消毒后的国槐种子接种于琼脂培养基中常规培养，7天后取种子长成的小苗的茎段转接到愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基中继代培养，20天后组培苗即可使用；(4)农杆菌侵染：取大而肥厚的组培苗大叶片放于加有步骤(2)制备好的农杆菌菌液的培育皿中，其中农杆菌菌液量以刚浸没叶片为准，用刀片划伤大叶片，然后将其转移至步骤(2)制备好的农杆菌菌液中侵染10～15min；(5)抗性植株选育：将上述侵染后的大叶片在愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基上培养2～3天，之后继代转入加有400～500mg·L-1的头孢霉素的愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基中培养15～20天，然后转入选择培养基I中选择培养25～30天，再转入选择培养基II中培养80～100天，继代4～5代得Kan抗性植株；其中，上述大叶片从农杆菌侵染后开始一直到转入选择培养基I中的15～20天内是放置在黑暗条件下培养，之后进行正常的昼夜光照周期培养，光照时间14h·d-1；(6)转化植株鉴定：用PCR和PCR-Southern方法对上述获得的Kan抗性植株进行检测，确定外源基因已经整合到植株基因组DNA中的转化植株；(7)转化植株培育：将确定的转化植株继代培养20～25天后，取健壮丛生芽小苗直接转入生根培养基生根；幼苗在生根培养基中生长15～20天，90％以上发育成健壮的生根幼苗；(8)幼苗移栽：将上述生根幼苗在温室条件下适应1～2天后，逐渐松开瓶口封膜以降低湿度，直至取掉封口膜，4～5天后洗净培养基，移入营养钵中，利用间歇喷雾装置或人工喷水保持环境湿度，经过驯化炼苗20～30天后，栽入花盆或大田；幼苗刚开始转入温室时，利用遮荫网遮荫，4～5天后仅在中午强光时遮荫5～7小时，并随天数增加而逐步减少遮荫时间，以增强光照，13～15天后全部去掉遮荫网；上述步骤中，步骤(2)所述YEB培养基的配方为：细菌蛋白胨5g·L-1，酵母浸膏1g·L-1，牛肉浸膏5g·L-1，MgSO4.7H2O 0.493g·L-1，pH7.0；步骤(3)所述琼脂培养基配方为：琼脂6～8g·L-1，pH值5.8～6.0；步骤(3)或(5)所述愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基配方为：MS培养基、6-BA 2.0～4.0mg·L-1、IBA 0.3～0.5mg·L-1、蔗糖25～35g·L-1、琼脂6～8g·L1，pH值5.8～6.0；所述培养的条件为：昼温度25℃，夜温度18℃，光照强度40umol.m-2.s-1，光照时间14h·d-1；步骤(5)所述选择培养基I的组成为：愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基、卡那霉素20～30mg·L-1；所述选择培养基II的组成为：愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基、卡那霉素40～60mg·L-1；步骤(7)所述继代培养用培养基是愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基，所述生根培养基的组成为：1/2MS培养基、IAA 0.4～0.6mg·L-1、蔗糖18～22g·L-1、琼脂6～7g·L-1，pH值5.8～6.0；所述培养的条件为：昼温度25℃，夜温度18℃，光照强度40umol.m-2.s-1，光照时间14h·d-1。