[发明专利]乙型肝炎病毒细胞株HepG2－RHBV的构建

摘要

本发明公开了一种乙型肝炎病毒细胞株HepG2－RHBV的构建，属人体疾病的预防与治疗的前期研究。本发明构建能稳定表达HBV相关抗原并复制的HepG2细胞株，作为模板的HBV DNA以重组DNA方式游离于细胞染色体外；以HepG2－RHBV细胞株应用于抗HBV药物的筛选；以构建的HepG2－RHBV细胞株为基础，进一步研究HBV对HepG2细胞的影响。由于本发明构建HBV自主复制的肝细胞株，使HBV在HepG2细胞中不仅能长期复制、表达特异性抗原及产生病毒颗粒，而且作为模板的HBV DNA以重组DNA方式游离于细胞染色体外，从而研究HBV对HepG2细胞的总体影响，分析HBV的可能致病机制，为临床治疗提供指导和依据。

主权项

1、一种乙型肝炎病毒细胞株HepG2-RHBV的构建，其特征是：(一)试剂：p56为pUC18重组载体，含全基因组HBV DNA，HBV DNA的preS2起始密码由CTG定点突变成ATG；HepG2细胞及HepG2.2.15细胞，均以含10％小牛血清的DMEM培养；(二)构建1.2倍体HBV DNA重组真核表达载体(1)片段A的获取以引物TBf和TBr从质粒pSEAP2-Basic中扩增0.1Kb的TB片段Transcription Blocker，总体积为50ul，用ABI 9700 PCR扩增仪扩增，采用热启动方式，待温度上升至94℃后加入聚合酶，反应经94℃预变性2分钟后进入循环，循环结束后72℃延伸7分钟；PCR产物与0.2倍体积的6×DNA上样缓冲液混匀后上样，1.5％琼脂糖凝胶，0.5×TBE电泳缓冲液，稳压120V，电泳30分钟；在紫外灯下将含目的基因片段的琼脂糖凝胶切下，置离心管中，用胶回收试剂盒回收DNA片段，每100mg琼脂糖凝胶加入300μl Solution I，65℃水浴10分钟，每隔两分钟颠倒一次，使胶完全溶解；混合液移入吸附柱中，10000g离心1分钟，弃去收集管中的液体；吸附柱中加入500μl Solution II，10000g离心1分钟，弃去收集管中的液体；再以solution II液重复洗柱一次；空柱10000g离心2分钟，将吸附柱置1.5ml离心管中，开盖放置2分钟使乙醇完全挥发，往吸附柱中央加入25μl灭菌双蒸水，室温静置5分钟后10000g离心1分钟洗脱DNA；PCR回收产物以Sal I、BamH I酶切，反应体系20μl，37℃水浴16h，酶消化产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后回收，该片段记为A；(2)片段B的获取以Sap I完全酶切p56-mut，反应体系100μl，37℃水浴16h，酶消化产物经0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收3.2kb的片段即完整的全基因组HBV DNA；回收产物进行自身连接，反应体系20μl，4℃连接24h，连接产物用DNA纯化试剂盒纯化，加入250μl Solution I，混合液移入吸附柱中，10000g离心1分钟，弃去收集管中的液体；吸附柱中加入500μl Solution II，10000g离心1分钟，弃去收集管中的液体；再以solution II液重复洗柱一次；空柱10000g离心2分钟，将吸附柱置1.5ml离心管中，开盖放置3分钟使乙醇完全挥发，往吸附柱中央加入25μl灭菌双蒸水，室温静置5分钟后10000g离心1分钟洗脱DNA；获得的环状HBV DNA记为#56-mut HBV DNA，以BamH I和Xba I双酶切，反应体积20μl，37℃水浴16h，酶消化产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后回收约2.0Kb片段，该片段记为B；(3)片段C的获取以Xba I和Rsr II双酶切p56-mut，反应体积20μl，37℃水浴16h，酶消化产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后胶回收试剂盒回收1.3Kb片段，该片段记为C；(4)片段D的获取用引物PC和PD从#56-mut HBV DNA中扩增0.6Kb DNA，总体积为50ul；PCR扩增条件同前，1.5％琼脂糖凝胶电泳后胶回收试剂盒回收约0.6Kb片段，并以Rsr II酶切，反应体积20μl；37℃水浴16h，酶消化产物经DNA纯化试剂盒纯化，纯化产物用SalI酶切，反应体积20μl；37℃水浴16h，酶消化产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后胶回收试剂盒回收约0.4Kb片段，该片段记为D；(5)pREP10载体的酶切以Sal I切除pREP10载体上的真核表达盒相关片段，包括CMV启动子、多克隆位点、SV40加尾信号，反应体积20μl；37℃水浴16h，酶消化产物经0.75％琼脂糖凝胶电泳后胶回收试剂盒回收约8.2Kb载体片段；(6)目的片段与载体的连接及转化以Sal I切除pREP10载体后回收的8.2Kb载体片段与A-D四个片段连接，构建重组载体pREP-HBV，反应体积30μl，4℃连接24h，将连接产物加入100μl感受态Top10细菌，冰浴30分钟，42℃热休克2分钟，快速置冰浴2分钟，加入0.8ml LB培养液，37℃、300rpm/分钟摇育45分钟；4000g离心2分钟收集细菌，将细菌涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的琼脂平板上，置于37℃温箱孵育16小时；(7)筛选重组克隆氨苄青霉素琼脂平板上挑取菌落，转种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，37℃、300rpm/分钟摇育8小时；取1.5ml菌液用质粒小量抽提试剂盒提取质粒，4000g离心2分钟收集细菌，加入250μl Solution I(25mM Tis-HCl，pH 8.0，10mM EDTA)震荡重悬细菌，加入250μl Solution II(0.2N NaOH，1％SDS)，颠倒混匀至菌液变清，加入350μl Solution III(3M KAc，pH5.5)，混匀；12000g离心10分钟，上清移入吸附柱内，12000g离心1分钟，弃收集管内的液体，加入500μl SolutionIV，12000g离心1分钟，弃收集管内的液体，加入650μl SolutionV，10000g离心1分钟，弃收集管内的液体，同法重复洗柱一次，弃收集管内的液体，空柱12000g离心2分钟；在吸附柱中央加入30μl灭菌三蒸水，12000g离心1分钟洗脱质粒DNA，该质粒记为pREP-HBV；pREP-HBV质粒含A-D四个外源DNA片段：A为扩增自pSEAP2-Basic载体的TB(Transcription Blocker)片段；B、C、D共同组成1.2倍体HBV DNA，由此构成一个完整的HBV转录单位，其中B片段位于HBV基因组1402nt-249nt，其5’端含HBV的核心启动子(Basic Core promoter，BCP)，C片段位于HBV基因组249nt-1573nt，D片段位于HBV基因组1573nt-2000nt，其3’端含加尾信号；取5μl质粒DNA，以Sal I酶切，反应体积为20μl，37℃水浴5小时，产物以1％的琼脂糖凝胶电泳；pREP-HBV经Sal I酶切出现两条DNA带，分别为8.2kb和3.9kb，后者由1.2倍体HBV DNA(3.8Kb)及TB片段(0.1Kb)组成；经BamH I酶切后，在8.9kb和3.2kb处可见两条DNA带，后者为1单位长度的HBV DNA；上述酶切结果与预期符合；相关序列以ABI3730型DNA自动荧光序列分析仪进行序列测定，测序引物如下：P1：5’AGACCACCAAATGCCCCTATC 3’P2：5’GGGTCACCATATTCTTGGGAAC 3’P3：5’CTCCGCGAGGACTGGGGACCC 3’P4：5’GCCATTTGTTCAGTGGTTCG 3’P5：5’CGCATGCGTGGAACCTTTGTG 3’PCR：5’AAGCCCAGTAAAGTTTCCCAC 3’Rep10-7：5’GTTGTACCAACCAACTGAAG 3’Reo10-1087：5’GTCCACGACTGGACTGAGCAG 3’(三)质粒DNA抽提、定量及DNA转染以Qiagen Plasmid Midi Kits大量抽提pREP-HBV质粒；菌株按1∶100接种至500ml LB培养液(含氨苄青霉素100μg/ml)，37℃震荡培养16小时；4000g离心10分钟收集细菌，加入10ml P1液，震荡重悬菌体；加入10ml P2液裂解细菌，置室温3分钟，使菌体完全裂解；加入10ml P3液，颠倒混合，冰浴20分钟；20000g离心30分钟，收集上清液体缓慢注入1用10ml QBT缓冲液平衡的Qiagen-tip500纯化柱，待滴完后用30ml QC缓冲液洗柱两次，后用15ml QF缓冲液洗脱DNA；洗脱液中加入10.5ml异丙醇，20000g离心30分钟，以5ml 70％乙醇漂洗DNA沉淀，42℃温箱中干燥5分钟后，将DNA溶于500μl灭菌三蒸水；取所获DNA 10μl，以紫外分光光度计测定OD260、OD280及比值，确定浓度为0.459μg/μl，OD260/OD280为1.968；HepG2细胞以含10％小牛血清的DMEM培养HepG2细胞，传代之前以0.25％胰酶、0.1％EDTA进行消化，按6×105细胞/孔，接种至6孔细胞培养板；20小时后，换新鲜的培养液(此时平皿中细胞覆盖已达80-90％)，4小时后进行转染；将Qiagen试剂盒大量抽提的质粒pREP-HBV，以Lipofectamine2000转染细胞；转染的质粒DNA量与Lipofectamine2000用量比例为1μg∶2μl；转染16小时后加入250μg/ml潮霉素筛选，每3d换培养液一次(含潮霉素)，约3周后形成抗潮霉素细胞集落，挑取细胞集落置24孔板，继续用含潮霉素的培养液培养、扩增、冻存。