[发明专利]一种检测线粒体糖尿病的45个基因位点微阵列芯片

摘要

本发明公开了一种检测线粒体糖尿病的45个基因位点微阵列芯片。其步骤是以醛基玻片为载体，其次是引物和探针设计，第三是芯片点阵布控，最后是监控系统与检测系统的点阵布控。监控系统由碱基突变位点的阴性对照、阳性对照和平行对照组成；检测系统为待检的mtDNA 45个位点的野生型和突变型探针。每芯片含1～3个0.04cm²的点样矩阵、每个矩阵90条探针、324个样点。实验操作流程简单，省时，成本低，仅需1次不对称PCR扩增和Cy5标记、1次杂交反应，即可检测1～3份不同标本的mtDNA 45个位点。适用于糖尿病患者和高危人群的检测，有助于临床特殊类型糖尿病的正确诊断和分类，早发现病人，早预防，早治疗。

主权项

1.一种检测线粒体糖尿病45个基因位点微阵列芯片，它包括下列步骤：A、以醛基玻片为载体；B、设计引物和探针：首先从MITOMAP、mtSNP、mtDB、PubMed、中国期刊网和重庆维普数据库中检索与糖尿病的线粒体基因/mtDNA突变位点；其次以线粒体基因剑桥碱基序列/GenBank#J01415.0 gi：337188为序列；第三是采用Primer Premier 5.0和NCBI BLAST软件，针对mtDNA 45个突变位点，设计特异性扩增目的DNA序列引物；特异性野生型和突变型寡核苷酸探针，退火温度为56.7℃～62℃，其5′端或3′端加载长臂15T后修饰氨基基团；C、芯片点阵布控：微阵列芯片为324个样点组成的18行×18列的矩阵，包括监控系统和检测系统，监控系统为：①芯片阴性对照，为探针稀释液，pH 8.0，1×TE Buffer，布控在有公共野生型探针的位点处，点样矩阵中，mtDNA 3200，3205与3206位点公用1条野生型探针，在mtDNA 3200和3205位点的突变型探针点样处下方，点印阴性对照；②芯片阳性对照，为mtDNA 3243和5178两个位点的4条探针按1∶1∶1∶1比例混合的5μM溶液，布控在微阵列芯片的左边3列，共54个阳性对照样点；③芯片平行对照，为各位点的5μM探针溶液平行点印3个点，在矩阵中mtDNA 1888位点的野生型探针和突变型探针各点印3个样点，共6个样点检测1个基因位点；检测系统由mtDNA 45个位点的野生型和突变型寡核苷酸探针布控的样点组成；每条探针采用pH8.0的1×TE Buffer稀释为5μM溶液，并点印3个平行点，共6个样点检测1个基因位点，45个基因位点从左到右顺序排列；D、监控系统与检测系统的点阵布控：监控系统与检测系统的点阵布控在同一区域，采用Packard芯片点样仪点印于醛基玻片上；室温保湿固定48～72小时，4℃冰箱保存备用；所述的特异性野生型和突变型寡核苷酸探针：所述的目的DNA序列引物：  引物  编号 序列，5′→3′ 扩增范围 产物长度  7 F：TCCAAAGACAACCATCATTCC R：GATTGATGAAAAGGCGGTTGA 14470-14944 475bp